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Monix
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3 Messaggi

Inserito il - 15 aprile 2010 : 19:48:50

Ciao mi sono appena iscritta al sito e avrei gi� bisogno del vostro aiuto!!! Qualcuno si occupa di trasfezioni??
io sto seguendo un esperimento con lo scopo di trasfettare delle colture cellulari con plasmidi che contengono il genoma del virus C al fine di ottenere un sistema in grado di generare particelle virali.
I problemi che ho avuto nel corso dell'esperimento sono una miriade (forse anche legati alla mia ignoranza circa molte tecniche di biologia molecolare in quanto sono un medico)ad ogni modo ho questi benedetti plasmidi di circa 11000 basi. li ho linearizzati con i rispettivi enzimi di restrizione partendo da una concentrazione iniziale di ca 10ug.ho corso un gel d'agarosio allo 0,5% e tagliato le bande purificato da agarosio trascritto per ottenere RNA e trasfettato con elettroporatore, bene non � riuscito!
allora sto rifacendo tutto e vorrei evitare di sbagliare.
1: per la purificazione ho usato un kit della quiagen con resina e non con colonnine ma la resa in termini di quantit� � stata molto bassa...avete consigli?
2: x la trascrizione ho usato il kit T7 megascript dell'ambion lo conoscete?? il protocollo diceva di partire da 1ug di DNA ma per template corti, per template pi� lunghi dice di usare tra 0,5 e 2 picomoli di DNA....Come faccio a calcolarmi le picomoli? o meglio quanti ul di campione concentrato a 1ug/ul devo prendere per usare 2 picomoli di template?
per il momento mi fermo qui
grazie a chiunque voglia dare il suo contributo
a presto

angemore
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82 Messaggi

Inserito il - 16 aprile 2010 : 12:41:59

Per la prima domanda non posso aiutarti perch� non conosco questi kit, per la seconda invece ecco qui:

Conversion of #956;g to pmol
pmol dsDNA= (ug dsDNA* 1515)/ numero paia di basi

un esempio:
1 microgrammo di un frammento a doppio filamento di DNA lungo 100 bp= (1*1515)/100 = 15.2 pmol

Conversion of pmol to #956;g
#956;g dsDNA= pmol dsDNA*numero bp*6.6*10-4(quest'ultima � una potenza, non una sottrazione)

Nel tuo caso specifico tu devi usare 2pmol di templato che corrispondono a:
2*11000*6.6*10-4= 14.52 microgrammi
dato che il tuo campione � concentrato 1 ug/ul ne dovrai prendere 14.52 ul