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 Inibendo il proteasoma...
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Gst
Utente Junior


Prov.: Roma
Città: Ariccia


143 Messaggi

Inserito il - 18 aprile 2010 : 11:53:27  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Gst Invia a Gst un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Salve ragazzi!

Mi servirebbe il vostro aiuto per risolvere un dubbio a cui ho cercato (vanamente) di rispondere cercando i + disparati articoli in pubmed.

E' un dubbio concettuale, inportantissimo per interpretare correttamente una serie di miei risultati sperimentali... quindi HELP

Ho usato l'MG132 per inibire il proteasoma in un mio sistema modello cellulare e sono poi andata a vedere i livelli delle mie proteine di interesse prima e dopo il trattamento mediante wb, utilizzando un anticorpo policlon contro le prot di mio interesse.

Come atteso (è noto che queste proteine sono substrato del proteasoma) i livelli di proteine dopo il trattamento con inibitore aumentano! Ciò che aumenta, però, è la proteina così come la vedo nel campione non trattato (stessa altezza, nessuno smear...) e quindi NON ubiquitinata!

MA... qui viene il dubbio... seguite il mio ragionamento:

se blocco il proteasoma, le proteine non possono + essere degradate dal proteasoma, ma vengono comunque ubiquitinate! Quindi ciò che dovrei vedere aumentare quando tratto con inibitore dovrebbe essere la mia proteina ma in forma ubiquitinata!!! Quindi con diverso peso molec... come smear... non so!

Invece, leggendo in letteratura, tutti inibiscono il proteasoma e vanno a vedere la proteina di interesse che aumenta di livello (quando è substr del proteasoma) ma la vedono alla stessa altezza del ctrl.. quindi non ubiquitinata.
PERCHè?!

Grazie a tutti voi, spero possa essere un quesito interessante anche per altri.

Spero di venirne a capo quanto prima...

Ascoltami con gli occhi...

domi84
Moderatore

Smile3D

Città: Glasgow


1723 Messaggi

Inserito il - 18 aprile 2010 : 12:06:08  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di domi84 Invia a domi84 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Mmm...il tuo ragionamento è corretto! Dovresti vedere uno smear(dovrebbero vederlo anche sugli altri lavori). Ci puoi dire che proteina è? Sei sicura che sia direttamente degradata da proteasoma per poliubiquitinazione?

Il mio blog: http://domi84.blogspot.com/
Le foto che ho scattato...
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Gst
Utente Junior


Prov.: Roma
Città: Ariccia


143 Messaggi

Inserito il - 18 aprile 2010 : 13:03:32  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Gst Invia a Gst un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ciao Domi! Grazie per avermi risposto così velocemente!

Le proteine sono regolatori del ciclo cellulare (inibitori: p21 e p27). e si! sono certa siano degradati dal proteasoma dopo poliubiquitinazione.

Stavo pensando a diverse possibili spiegazioni:
forse dei limiti tecnici? ma ciu credo poco...

Ascoltami con gli occhi...
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Dionysos
Moderatore

D

Città: Heidelberg


1913 Messaggi

Inserito il - 18 aprile 2010 : 13:46:25  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Dionysos  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di Dionysos Invia a Dionysos un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Sarebbe interessante conoscere la stabilità della forma
poliubiquitinata in assenza di attività del proteasoma:
potrebbe darsi che non essendoci un proteasoma disponibile
a digerirla, questa sia molto rapidamente deubiquitinata.

Anyway: l'ubiquitina pesa intorno a 8 kDa, o sbaglio? sei
sicura di essere nelle giuste condizioni (percentuale di gel,
zona di migrazione) per poter risolvere bene una differenza
tra forma ubiquitinata e non?

Volere libera : questa é la vera dottrina della volontà e della libertà
(F.W. Nietzsche)

Less Jim Morrison, more Sean Morrison!


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Gst
Utente Junior


Prov.: Roma
Città: Ariccia


143 Messaggi

Inserito il - 18 aprile 2010 : 14:08:11  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Gst Invia a Gst un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Uno dei miei dubbi "tecnici" era proprio quello della risoluzione del mio gel!

Io corro in genere gel al 12%, per vedere proteine che pesano 21-27 KDa (in modo da separarle sullo stesso gel).
Inoltre blotto l'anticorpo solo sulla parte bassa del gel (fino a 36 KDa).
D'altra parte mi è capitato di correre i miei campioni anche su un gel al 9% (più lasso non posso: perdo la prot a 21 KDa) e ho blottato l'anticorpo su tutto il filtro, ma ninente! In quel caso però non ero riuscita ad apprezzare nemmeno la singola banda all'altezza di 21: forse l'avevo persa?!

Stavo comunque pensando di ricorrere gli stessi campioni anche su un gel a gradiente 4-12%: forse sarebbe l'ideale!

Un altro possibile problema tecnico che ho messo in conto è: forse non solubilizzo le peoteine poliubiq con il mio buffer di lisi?

La tua osservazione sulla possibile de-ubiquitinazione è davvero molto interessante! :) Anche se non so dare una risposta!

D'altra parte, rimane da capire perchè tutta la comunità scientifica non guarda la prot poliubiquit dopo l'inib del proteasoma ma quella all'altezza normale?! Non vedo la spiegazione teorica, dato il mio ragionamento!!!

Grazie 1000 per la risposta!

Ascoltami con gli occhi...
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domi84
Moderatore

Smile3D

Città: Glasgow


1723 Messaggi

Inserito il - 18 aprile 2010 : 14:41:28  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di domi84 Invia a domi84 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ho cercato un immagine molto velocemente. Qui però mi sembra di capire che lo vedano ubiquitinato p27
http://bloodjournal.hematologylibrary.org/content/vol111/issue9/images/large/zh80090818950001.jpeg

Il mio blog: http://domi84.blogspot.com/
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Gst
Utente Junior


Prov.: Roma
Città: Ariccia


143 Messaggi

Inserito il - 18 aprile 2010 : 15:01:36  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Gst Invia a Gst un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Domi non vorrei contraddirti... ma se ci fai caso (e se io non interpreto male le immagini), l'unico esperimento in cui usano inibitore del proteasoma (mg132) e vanno a vedere p27 (immagine C, terzo pannello a destra) non lo vedono come smear, e quindi poliubiquit, ma all'altezza di p27!

Grazie comunque... magari tutti insieme riusciamo a capirci qualcosa...



Ascoltami con gli occhi...
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domi84
Moderatore

Smile3D

Città: Glasgow


1723 Messaggi

Inserito il - 18 aprile 2010 : 19:40:49  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di domi84 Invia a domi84 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
hai ragione!!! avevo guardato la prima immagine...che però credo sia in vitro...
Strana questa cosa...ci penserò (e magari mi leggo anche l'articolo)

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darkene
Utente Junior

occhi



291 Messaggi

Inserito il - 18 aprile 2010 : 20:35:02  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di darkene Invia a darkene un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
scusa Gst, avrei una curiosità:
- che concentrazione di MG132 usi?
- per quanto tempo?
- su quali cellule?
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kristanko
Utente Junior

Città: Bologna


123 Messaggi

Inserito il - 19 aprile 2010 : 11:45:30  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di kristanko Invia a kristanko un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
domanda scema e forse da incompetente... ma l'Ab riconosce la proteina ubiquitana?
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Gst
Utente Junior


Prov.: Roma
Città: Ariccia


143 Messaggi

Inserito il - 19 aprile 2010 : 21:10:17  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Gst Invia a Gst un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ciao Darkene.

Io uso MG132 15 micromolare per 6 ore, su Mefs (fibroblasti embrionali murini: è una linea primaria). So ke a questi tempi e concentrazioni il proteasoma nel mio sistema è inibito perchè ho controllato facendo un wb utilizzando un anticorpo anti-ubiquitina in estratto totale di cell trattate e non: la quantità di prot ubiquitinate dopo il trattamento è molto + alta rispetto alle cellnn trattate.

E per quanto riguarda la domanda se l'anticorpo riconosca la forma ubiquitinata, non è assolutamente una stupida domanda! Io ho banalmente pensato ke per wb la proteina è completamente denaturata, quindi in teoria l'epitopo ke l'anticorpo riconosce non dovrebbe essere mascherato dall'ubiquitina. Inoltre sono andata avedere 2 diverse proteine, ke rivelo con 2 diversi anticorpi, ovviamente, e non riesco a vedere nessuna delle 2 come ubiquitinata!

Grazie ad entrambi per l'interessamento
spunti di riflessione son sempre ben accetti!

Ascoltami con gli occhi...
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Neggy
Nuovo Arrivato



10 Messaggi

Inserito il - 19 aprile 2010 : 21:56:29  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Neggy Invia a Neggy un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ciao ragazzi io non sono un ricercatore, solo uno studente alle prime armi, quindi forse (anzi probabilmente) sparo una boiata colossale però tanto che mi è venuta in mente la butto li. Premetto che non ne so nulla di tecniche di laboratorio, quindi ho pensato solo ad una possibile soluzione teorica per cui a proteina in questione non è presente in forma ubiquitinata:

non è possibile che la reazione (una delle tre o tutte) di ubiquitinazione abbia una costante di equilibrio estremamente bassa e che in vivo proceda solo per il rapido consumo dei prodotti da parte del proteasoma e che quindi in assenza di questo la proteina in forma ubiquitinata sia presente in quantità talmente bassa da non essere rilevata?
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SpemannOrganizer
Utente

Spemann

Città: Los Angeles


955 Messaggi

Inserito il - 20 aprile 2010 : 11:10:17  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di SpemannOrganizer Invia a SpemannOrganizer un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
GST, scusa la domanda ma sulla tua proteina fai una doppia marcatura? Cioè usi sia l'anticorpo anti-ub che l'anticorpo anti-p27?
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Gst
Utente Junior


Prov.: Roma
Città: Ariccia


143 Messaggi

Inserito il - 21 aprile 2010 : 19:28:55  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Gst Invia a Gst un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ciao Neggy!

Anche io avevo pensato ad una spiegazione teorica tal quale la tua... o simile :) ma se così fosse...
visto quanto è studiato il proteasoma, e visto quanto è frequente un esperimento come quello ke ho fatto io...
in letteratura dovrebbe essere riportata questa "teoria" che giustifica il perchè tutti vanno a vedere la proteina non ubiquitinata ma quella al peso molec "giusto".

Per caso tu lo hai letto da qualche parte?

Ascoltami con gli occhi...
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Gst
Utente Junior


Prov.: Roma
Città: Ariccia


143 Messaggi

Inserito il - 21 aprile 2010 : 19:30:51  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Gst Invia a Gst un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
P.S. io vado a vedere p27 endogeno usando un anticorpo anti-p27. D'altra parte ho fatto un wb per rilevare tutte le proteine ubiquitinate dopo aver trattato con Mg132! in questo secondo caso ho usato un anticorpo anti-Ubiquitina.

Ascoltami con gli occhi...
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Neggy
Nuovo Arrivato



10 Messaggi

Inserito il - 22 aprile 2010 : 11:13:45  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Neggy Invia a Neggy un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
No la mia è solo un ipotesi, non l'ho letta da nessuna parte.
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SpemannOrganizer
Utente

Spemann

Città: Los Angeles


955 Messaggi

Inserito il - 22 aprile 2010 : 13:20:12  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di SpemannOrganizer Invia a SpemannOrganizer un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Una possibile spiegazione al tuo risultato potrebbe essere che Mg132 inibisce la degradazione proteasome-mediated delle proteine semplicemente inibendo la loro ubiquitinazione. Ergo per cui la forma che aumenta è quella nn ubiquitinata che quindi non può essere degradata dal proteasoma. Farò delle ricerche su internet per trovare conferma o meno sul meccanismo d'azione di Mg132
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SpemannOrganizer
Utente

Spemann

Città: Los Angeles


955 Messaggi

Inserito il - 22 aprile 2010 : 13:34:48  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di SpemannOrganizer Invia a SpemannOrganizer un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Mah, non so che dirti... ho appena trovato un lavoro dove osservano un aumento di proteine poliubiquitinate dopo uso di Mg132...
il link al lavoro è questo http://www.sciencedirect.com/science?_ob=ArticleURL&_udi=B6W81-4K96S9G-1&_user=829662&_coverDate=09%2F30%2F2006&_rdoc=1&_fmt=high&_orig=search&_sort=d&_docanchor=&view=c&_searchStrId=1305920904&_rerunOrigin=google&_acct=C000044719&_version=1&_urlVersion=0&_userid=829662&md5=171514b519b20b3aab9215bfa603251b


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SpemannOrganizer
Utente

Spemann

Città: Los Angeles


955 Messaggi

Inserito il - 22 aprile 2010 : 13:48:12  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di SpemannOrganizer Invia a SpemannOrganizer un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ultima cosa... hai provato a immunoprecipitare la tua proteina e poi blottarla con anti-polyubiquitin? Sulla rete ho trovato risultati analoghi al tuo e altri discordanti comunque
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Iside
Utente Attivo

Iside_paradise

Città: Napoli


1375 Messaggi

Inserito il - 23 aprile 2010 : 11:16:46  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Iside  Invia a Iside un messaggio Yahoo! Invia a Iside un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
d'accordo con spemannorganizer. che la tua proteina sia ubiquitinata o no, la specificità dell'anticorpo è sempre la stessa. quindi, a meno che i siti di ubiquitinazione non siano gli stessi che fungano da epitopo, l'anticorpo rivelerà sempr euna banda. la soluzione di immunoprecipitare mi smebra la migliore.
quello che ancora mi lascia un dubbio dopo la lettura della discussione è: come mai il PM della proteina poli-ubiquitinata è lo stesso della proteina NON poli-ubiquitinata? cioè, io mi aspetterei sempre una sola banda ma a un PM più alto. tu tagli il filtro prima di blottare?
altra domanda, forse scema: esiste in commercio un ab che riconosce la forma ubiquitinata di p21/27?

...we're just two lost souls swimming in a fishbawl...year after year...
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cami
Utente Junior

p

Città: roma


136 Messaggi

Inserito il - 23 aprile 2010 : 12:19:49  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di cami Invia a cami un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
io per vedere la forma ubiquitinata di una proteina in genere faccio l'immunoprecipitazione, come ti è stato già suggerito... visti i problemi che stai avendo questa dovrebbe essere la soluzione migliore...
mi sta venendo un dubbio comunque... tu hai detto che:
Citazione:
[i]Io corro in genere gel al 12%, per vedere proteine che pesano 21-27 KDa (in modo da separarle sullo stesso gel).
Inoltre blotto l'anticorpo solo sulla parte bassa del gel (fino a 36 KDa).

giusto?
non sarà troppo poco? voglio dire, se la tua proteina è poliubiquitinata dovrebbe pesare molto di più, io mi aspetterei lo smear nella parte alta del gel... o forse non ho capito bene il tuo discorso...
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SpemannOrganizer
Utente

Spemann

Città: Los Angeles


955 Messaggi

Inserito il - 23 aprile 2010 : 12:34:49  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di SpemannOrganizer Invia a SpemannOrganizer un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Riguardo alla concentrazione del gel, ho visto lavori in cui usavano gel all'8%
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Gst
Utente Junior


Prov.: Roma
Città: Ariccia


143 Messaggi

Inserito il - 23 aprile 2010 : 16:33:42  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Gst Invia a Gst un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ciao Iside, cami e spemann!

Grazie per le risposte.

Mi è capitato di correre i miei campioni anche su un gel a gradiente: 4-12% e incubare l'anticorpo (anti-p21 o anti-p27)su tutto il filtro. In quei casi avrei dovuto vedere p21 o p27 ad un peso molec + alto del loro, cosa che poteva far presagire una loro ubiquitinazione.
Io nn li ho mai visti però!!!!!

Inoltre: NO, non esistono ig anti p27 ubiquitinato, ke io sappia, nè anti-p21 ubiquit.

Comunque, grazie per l'interesse, ma la mia domanda iniziale era un'altra in realtà

Rispondo invece a "nn ricordo chi" suggeriva che mg132 potrebbe inibire l'ubiquitinaz delle prot: NO, in realtà è un piccolo peptide che blocca l'attività catalitica del proteasoma.

Grazie a tutti per gli spunti interessanti!

Ascoltami con gli occhi...
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