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Farabot
Nuovo Arrivato
10 Messaggi |
 Inserito il - 19 aprile 2010 : 13:08:15
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Qualcuno ha idea di come fare per mettere un gene esogeno a valle di un promotore noto, in una linea cellulare?
Tipo, devo fare esprimere alle HEK cells un gene estraneo sotto il promotore della GSK1.
Grazie in anticipo
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darkene
Utente Junior
291 Messaggi |
Inserito il - 19 aprile 2010 : 15:40:14
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| cloni il gene in un plasmide di espressione a valle del tuo promotore e fai una transfezione stabile! |
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Farabot
Nuovo Arrivato
10 Messaggi |
Inserito il - 19 aprile 2010 : 15:54:29
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Grazie per la risposta....
il problema e' che vorrei mettere il mio gene di interessa a valle del promotore che dico io, in modo da silenziare contemporaneamente in gene che nei w.t. e' sotto quel promotore.
W.T.: Promotore A----gene A
t.g.: Promotore A--transgene--gene A(non + codificante)
questo vorrei fare...ma non so se e' possibile.....
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Dionysos
Moderatore
Città: Heidelberg
1913 Messaggi |
Inserito il - 19 aprile 2010 : 16:03:54
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Quello che vuoi fare è una gene disruption con ricombinazione omologa:
devi usare un costrutto di gene targeting con braccia di omologia
flanking, cioè : 5'-homology arm- [transgene]-3'homology arm .
Significa che devi clonarti un pezzo a monte e un pezzo a valle
della regione dove vuoi che il tuo transgene si inserisca: rispetto
all'alternativa postata da darkene, quello che tu vuoi fare è molto
più difficile e avrai un'efficienza bassissima. Per questo faresti
bene a inserire un'addizionale marcatore di resistenza tra i due arms.
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Volere libera : questa é la vera dottrina della volontà e della libertà
(F.W. Nietzsche)
Less Jim Morrison, more Sean Morrison!
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Neuroscience
Utente
659 Messaggi |
Inserito il - 19 aprile 2010 : 23:51:12
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la probabilità di ricombinazione omologa in linee cellulari stabili è molto remota.
Bisogna pensare che si reputa accettabile una ricombinazione ogni ogni milione di cellule ES, poi facendo la selezione si arriva a circa 3-4 su 100.
Nelle linee cellulari è migliaia di volte meno efficiente il sistema.
Tenetene conto.
Per queste cose si vendono dei sistemi di ricombinazione, enzima ricombinante + shuttle vector, ma che io ne sappia si usa nei batteri, non so per le cellule eucariotiche.
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Dionysos
Moderatore
Città: Heidelberg
1913 Messaggi |
Inserito il - 19 aprile 2010 : 23:54:28
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Esiste la possibilità di forzare la ricombinazione omologa in cell
lines utilizzando meganucleasi o zinc finger nuclease, con innalzamento
della probabilità di gene targeting da 0,00(ecc.)1% fino al 55%,
(ho visto il dato personalmente) ma il sistema è costosissimo ed
è stato utilizzato con successo (per ora) solo su un ristretto
numero di loci. Comunque è possibile. |
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Farabot
Nuovo Arrivato
10 Messaggi |
Inserito il - 20 aprile 2010 : 09:57:56
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Ragaazzi grazie dei suggerimenti, adesso mi faccio un giro in rete e vedo quanto puo' essere fattibile.
Buona giornata a tutti |
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SpemannOrganizer
Utente
Città: Los Angeles
955 Messaggi |
Inserito il - 21 aprile 2010 : 15:41:29
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| Meganucleasi,trasposasi ecc aumentano moltissimo la frequenza di integrazione del gene esogeno nel genoma dell'organismo ospite. Vengono infatti usate per la produzione di organismi transgenici. Però l'integrazione di questi geni è ancora casuale (a meno che non si inseriscano nel gene i siti target- o siano già presenti-).Del resto oggi come oggi è assai diffuso il sistema inducibile loxp-Cre, che oltre ad assicurare appunto inducibilità di ricombinazione dovrebbe anche essere più efficiente (nonostante siano a volte riportati casi di mosaicismo). |
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Dionysos
Moderatore
Città: Heidelberg
1913 Messaggi |
Inserito il - 25 aprile 2010 : 01:42:29
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Citazione:
Però l'integrazione di questi geni è ancora casuale (a meno che non si inseriscano nel gene i siti target- o siano già presenti-)
In genere vengono disegnate in modo tale da riconoscere siti specifici
che sono sufficientemente lunghi da essere unici nel genoma, per cui
quando dimerizzano correttamente sono quanto di più specifico ci sia in giro [dai un occhio qui.]
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SpemannOrganizer
Utente
Città: Los Angeles
955 Messaggi |
Inserito il - 25 aprile 2010 : 10:02:23
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Grazie della segnalazione Dionysos! Ho letto in parte l'articolo, in effetti si tratta di nucleasi ingegnerizzate in modo da poter riconoscere siti target specifici e desiderati dallo sperimentatore. Avevo letto in precedenza qualcosa, ma non ho approfondito. Quello che posso dire è che potrebbero rappresentare il futuro, ma ora come ora non mi pare che siano stra-diffuse.
Nel nostro lab usavano meganucleasi per aumentare la frequenza di inserzione, random, di transgeni in Xenopus. Poi si son accorti che l'efficienza era migliorata solo marginalmente, e hanno smesso di usarla.
Ad oggi i sistemi più diffusi che utilizzano endonucleasi o ricombinasi sono i sistemi Cre (LoxP) e Flp (FRT). Sistemi che ovviamente aumentano di molto la frequenza di ricombinazione, ma sono diversi da quelli che evidenzi tu e che non danno ricombinazione omologa (non nel senso stretto del termine, quanto meno, si tratta infatti di ricombinazione sito specifica). Anche qui però il sito che vuoi eliminare deve essere affiancato da siti loxP (o Frt)che però normalmente vengono inseriti sempre il vecchio sistema di ricombinazione omologa. Ripeto questo sistema è differente da quello che dici tu, e probabilmente non ha molto senso confrontarli.
Grazie ancora per la segnalazione comunque |
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