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mo-lab
Utente Junior

Città: utrecht


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Inserito il - 28 aprile 2010 : 17:30:57  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di mo-lab Invia a mo-lab un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ciao,
avrei una domanda riguardante la defosforilazione durante i clonaggio..se io taglio il mio vettore e il mio inserto con 2enzimi diversi non ho bisogno di fare la cip giusto?
QUanto vettore e inserto mettete nella ligasi?
il mio inserto e circa 1000 bp mentre il vettore all incirca 3000

SpemannOrganizer
Utente

Spemann

Città: Los Angeles


955 Messaggi

Inserito il - 28 aprile 2010 : 17:51:31  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di SpemannOrganizer Invia a SpemannOrganizer un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
In teoria non ce ne sarebbe bisogno, io però in pratica la faccio ugualmente e questo aumenta l'efficienza di ligation inserto::vettore (ammettiamo per esempio che non tutto il tuo vettore sia stato digerito completamente dai tuoi due enzimi: esisterà una piccola percentuale digerita solo dall'uno o dall'altro: se così è la reazione favorita dalla ligasi sarà la ricircolarizzazione di questa piccola percentuale di vettore).
Per quanto riguarda la ratio inserto:vettore c'è una teoria basata su lunghezza vettore e concentrazione assoluta estremità (termini) delle molecole di DNA in soluzione (la trovi spiegata dettagliatamente sul maniatis). Io uso in genere un rapporto molare 3:1 o 2:1 inserto:vettore. Le relative concentrazioni si possono ulteriormente modificare (per esempio puoi usare un rapporto 1:1) e dipende anche da reazione a reazione. Ti suggerisco quindi di provare diversi rapporti molari.
Io preferisco usare la standard ligase (almeno un'ora a R.T., meglio se overnight a 16°C), ma ci sono anche kit di ligation da 5 minuti (mai provati).

Fai gli opportuni controlli (positivi e negativi).



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mo-lab
Utente Junior

Città: utrecht


348 Messaggi

Inserito il - 28 aprile 2010 : 17:58:25  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di mo-lab Invia a mo-lab un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
io si e funzionano!!!
Cmq grazie mille..corro a leggere il maniatis
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mo-lab
Utente Junior

Città: utrecht


348 Messaggi

Inserito il - 29 aprile 2010 : 08:00:46  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di mo-lab Invia a mo-lab un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
quanto dna del vettore e dell inserto digerisci?
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SpemannOrganizer
Utente

Spemann

Città: Los Angeles


955 Messaggi

Inserito il - 29 aprile 2010 : 12:09:26  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di SpemannOrganizer Invia a SpemannOrganizer un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Citazione:
Messaggio inserito da mo-lab

quanto dna del vettore e dell inserto digerisci?



Dipende. Nell'ultimo clonaggio che ho fatto ho digerito ben 5 microgrammi di vettore (doppia digestione, purificazione defosforilazione, purificazione dal gel ecc... quindi un pò se n'è perso per la strada).

Per quanto riguarda l'inserto generalmente lo amplifico per pcr con primers contenenti i siti di restrizione. Controllo su gel, poi purifico da gel, Digerisco e ri-purifico tutto quello che ho ottenuto dalla pcr stessa.


Discorso diverso è quanto ne uso per la ligation però ti ho detto dipende sempre da inserto e vettore. Generalmente uso una ratio inserto:vettore 3:1 e per ora nn ho avuto problemi.
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mo-lab
Utente Junior

Città: utrecht


348 Messaggi

Inserito il - 29 aprile 2010 : 16:09:16  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di mo-lab Invia a mo-lab un Messaggio Privato  Rispondi Quotando

pensi che se anziche tagliarlo dal gel l inserto me lo precipito non e meglio?
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SpemannOrganizer
Utente

Spemann

Città: Los Angeles


955 Messaggi

Inserito il - 29 aprile 2010 : 16:22:09  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di SpemannOrganizer Invia a SpemannOrganizer un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Citazione:
Messaggio inserito da mo-lab


pensi che se anziche tagliarlo dal gel l inserto me lo precipito non e meglio?



Io preferisco dal gel in quanto se ci sono aspecifici dalla pcr li elimino, taglio solo la banda che mi interessa. Inoltre non mi porto dietro lo stampo che ho usato per la pcr (che sarà sicuramente in quantità piccolissime e diluito però preferisco non portarmi dietro nessuna schifezza).


Poi dipende, se l'inserto lo tagli direttamente da un vettore e lo inserisci nell'altro senza passare per pcr, te lo dovrai necessariamente purificare dal gel.


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mo-lab
Utente Junior

Città: utrecht


348 Messaggi

Inserito il - 30 aprile 2010 : 19:32:59  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di mo-lab Invia a mo-lab un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
domanda..ieri ho fatto la doppia digestione..il mio pezzo da levare e circa 1000 il vettore e 5000..dopo la doppia digestione ho
1) banda a 1000
2) banda a 4000
3) banda a 1700???
cos e??non dirmi una contaminazione..
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SpemannOrganizer
Utente

Spemann

Città: Los Angeles


955 Messaggi

Inserito il - 30 aprile 2010 : 19:48:00  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di SpemannOrganizer Invia a SpemannOrganizer un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
difficile dare una risposta senza avere una mappa del plasmide-inserto e siti di restrizione usati.
Io vedo due stranezze comunque, non solo la banda a 1700 ma anche la banda a 4000. Se il vettore nudo è 5000, e la doppia digestione rimuove solo l'inserto senza digerire altri punti io mi aspetterei:
banda a 5000
banda a 1000

Sei sicura che i siti di restrizione siano unici? Come hai fatto la doppia digestione? prima un enzima e poi l'altro o entrambi insieme? Se quest'ultimo caso, Il buffer che hai usato era compatibile per entrambi?

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mo-lab
Utente Junior

Città: utrecht


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Inserito il - 01 maggio 2010 : 18:53:37  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di mo-lab Invia a mo-lab un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
credo di aver scritto male io...non e mille piu 5000 ma mille piu 4000..i siti sono unici si..
scusa per le e senza accento ..(tastiere dutch)
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SpemannOrganizer
Utente

Spemann

Città: Los Angeles


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Inserito il - 01 maggio 2010 : 19:10:15  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di SpemannOrganizer Invia a SpemannOrganizer un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Allora... ma questa doppia digestione l'hai fatta su cosa? su ciò che hai ottenuto dopo una ligation? che tipo di clonaggio hai fatto? Blunt end, sticky end o half blunt? Tu hai detto che il tuo inserto è circa mille, quanto di preciso? La prima cosa che mi viene in mente è che possa essere un inserzione multipla (forse il tuo inserto si è inserito due volte). Ma è solo un'ipotesi. Hai provato a digerire con un enzima solo e a vedere a quanto ti migra?
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mo-lab
Utente Junior

Città: utrecht


348 Messaggi

Inserito il - 02 maggio 2010 : 14:23:42  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di mo-lab Invia a mo-lab un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
ma questa doppia digestione l'hai fatta su cosa? su un pcs2 con dentro lagfp...con l obiettivo di levare il cmv
clonaggio con sal1 e nco1
l inserto e 989
Hai provato a digerire con un enzima solo e a vedere a quanto ti migra?no

cmq ieri ho trasformato e oggi ho avuto le colonie..
ctr neg una sola colonia
lealtre piastre circa una 30
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SpemannOrganizer
Utente

Spemann

Città: Los Angeles


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Inserito il - 02 maggio 2010 : 14:45:49  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di SpemannOrganizer Invia a SpemannOrganizer un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Complimenti per le colonie ottenute. Controlla che siano ok dopo l' estrazione da colture batteriche. Io in genere faccio così: linearizzo con un enzima per vedere a che altezza migra il vettore-inserto. poi taglio con tutti e due gli enzimi di restrizione per vedere se salta fuori l'inserto. poi dopo mando a sequenziare. A volte per essere sicuro della presenza dell'inserto c'ho fatto una pcr in luogo della doppia digestione.

Credo che nn dovresti avere problemi. Forse quella banda a 2000 era semplicemente l'inserto ligato due volte. Se quella doppia digestione l'hai fatta sul prodotto della ligation, è possibile che insieme al plasmide buono tu avessi anche dei concatameri (inserto-inserto). Questo però non dovrebbe darti tanti problemi con la trasformazione, in quanto il DNA plasmidico si trasforma meglio di quello lineare e poi comunque c'è la selezione con l'antibiotico...


la colonia solitaria nel ctrl negativo potrebbe indicarti che nn tutto il vettore è stato digerito/defosforilato completamente.però una sola.. nn dovrebbe darti problemi. Hai usato stesse quantità e rapporti DNA-batteri per ligation e per controlli negativi?


Facci sapere come è andata poi! Ti auguro che siano tutti clonaggi perfetti!
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mo-lab
Utente Junior

Città: utrecht


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Inserito il - 02 maggio 2010 : 15:00:46  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di mo-lab Invia a mo-lab un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
si ho usato gli stessi rapporti (nel senso buffer ligasi e plasmideli ho lasciati uguali e ho fatto 3 piastre con 3differenti concentrazione di inserto e il ctr negativo senza)..guarda..una su 30 non dovrebbe avere valenza statistica (spero)..sono andata a vedere le colonie dopo 18 ore (so stanca avevo 3gg di ferie e ho lavorato TUTTI e 3 i gg)e qualcuna ha qualche microsatellite ma sti cavoli...spero siano buone..ho tagliato tutto dagel quindi credo di non essermi trascinata porcherie dietro..la cip non lho fatta cmq forse e quella colonia è plasmide indigerito..boh..ti aggiorno...
grazie mille!!
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mo-lab
Utente Junior

Città: utrecht


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Inserito il - 02 maggio 2010 : 15:03:38  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di mo-lab Invia a mo-lab un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
ps:tu fai pcr dacolonia o da mini prep?
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SpemannOrganizer
Utente

Spemann

Città: Los Angeles


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Inserito il - 02 maggio 2010 : 15:09:07  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di SpemannOrganizer Invia a SpemannOrganizer un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
mini-prep.

Ancora in bocca al lupo!
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mo-lab
Utente Junior

Città: utrecht


348 Messaggi

Inserito il - 03 maggio 2010 : 15:57:34  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di mo-lab Invia a mo-lab un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
la mia pcr da colonia non ha funzionato..pero non l avevo mai fatta prima..posso credere siano falsi positivi??
domani faccio la mini prep
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