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cami
Utente Junior

p
Città: roma


136 Messaggi

Inserito il - 29 aprile 2010 : 11:24:07  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di cami Invia a cami un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
ciao a tutti!
avrei bisogno di un aiutino a capire qualcosa sulle trasformazioni batteriche, dato che sto avendo non poche difficoltà a estrarre il DNA plasmidico dai miei mostriciattoli, ed essendo completamente ignorante in materia, ovviamente non capisco perché...
il mio problema è questo: normalmente utilizzo il kit maxiprep della Qiagen, quindi metto in coltura i batteri prendendoli direttamente da delle glycerol che stanno a -80°C, e che a quanto pare sono state preparate da irreperibili ignoti, i quali proprio perchè sono irreperibili E ignoti, non mi possono aiutare (non so nemmeno quali batteri sto usando, anche se penso siano E. coli DH5alpha). ultimamente mi stanno venendo delle rese orribili, nel senso di ottima qualità, ma bassissima quantità, e come me, anche altri stanno avendo lo stesso problema... un paio di mesi fa ho provato a farmi prestare un'aliquota di glycerol stock da un altro gruppo per estrarre pEGFP, e mi è venuta una resa ottima, mentre ora che sto cercando di estrarre un altro plasmide dalle mie glycerol, mi viene di nuovo una quantità irrisoria (il plasmide è un high copy e in due prove fatte, da 250ml di coltura batterica ho ottenuto rispettivamente 81 e 15 ug tot...).
la differenza tra le mie e le altrui glycerol è la data di preparazione (le mie hanno almeno 3 anni), quindi mi chiedevo: i batteri possono perdere il plasmide? o può esserci qualche altro meccanismo per cui col tempo le stock si rovinano?
grazieeeee!!!!

SpemannOrganizer
Utente

Spemann

Città: Los Angeles


955 Messaggi

Inserito il - 29 aprile 2010 : 12:19:42  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di SpemannOrganizer Invia a SpemannOrganizer un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Citazione:
Messaggio inserito da cami

ciao a tutti!

il mio problema è questo: normalmente utilizzo il kit maxiprep della Qiagen, quindi metto in coltura i batteri prendendoli direttamente da delle glycerol che stanno a -80°C, e che a quanto pare sono state preparate da irreperibili ignoti, i quali proprio perchè sono irreperibili E ignoti, non mi possono aiutare (non so nemmeno quali batteri sto usando, anche se penso siano E. coli DH5alpha). ultimamente mi stanno venendo delle rese orribili, nel senso di ottima qualità, ma bassissima quantità, e come me, anche altri stanno avendo lo stesso problema...







Mah, è possibile che questi stock in glicerolo siano stati semplicemente preparati male? Magari le cellule hanno una bassa efficienza di trasformazione, oppure è stato aggiunto meno glicerolo del dovuto, distruggendole quando le metti a -80.


Controlla la OD600 dopo la coltura O.N. a 37°C
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angemore
Nuovo Arrivato



82 Messaggi

Inserito il - 29 aprile 2010 : 12:54:55  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di angemore Invia a angemore un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Dando per assodato che il kit funziona bene e che non sei tu a fare errori nella lisi e nell'estrazione (dal momento che con EGFP hai avuto una buona resa), allora direi che 3 anni per un glycerol stock sono tanti!!!se ci pensi a quante volte magari il -80 è stato aperto/richiuso, ecc...
Anche io ti suggerirei di controllare gli OD600 come ti ha già detto Spemann per vedere come crescono i batteri e mi sa che ti convenga anche rifare gli stock ma trasformando i plasmidi che hai ottenuto dalle altre prep(dopo averli digeriti e controllati su gel tanto per essere sicura che sia quello il tuo plasmide) nei batteri che vuoi tu (ad es.DH5a).
Così elimini ogni variabile e se non ottieni i risultati che speri allora non te la puoi prendere con gli ignoti irreperibili
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cami
Utente Junior

p

Città: roma


136 Messaggi

Inserito il - 30 aprile 2010 : 12:40:10  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di cami Invia a cami un Messaggio Privato  Rispondi Quotando

grazie mille! in effetti stavo pensando di rinnovare le glycerol, anche per togliermi il dubbio sulla natura del mio problema (kit/operatore/tempo), però siccome come dicevo non sono molto preparata sull'argomento, volevo capire bene per quale motivo le glycerol stock si rovinano col tempo, quindi grazie!
a questo punto aprofitterei dell'occasione per fare un'altra domanda: vi è mai capitato di avere un vettore vuoto e il rispettivo vettore con un gene inserito che abbiano due resitenze diverse? (mi riferisco sempre alla crescita dei batteri). ve lo chiedo perchè a me sembra molto strano, però non si sa mai... il fatto è che io in realtà non conosco la resistenza presente nel mio plasmide, perchè ci è stato dato da un altro gruppo in un altro laboratorio ai tempi che furono, e nessuno quella volta si è scritto la resistenza... cercando in internet ho visto che questo vettore (pBABE-neo) generalmente è resistente all'ampicillina, per cui ho provato con quella, ma mi sono cresciuti solo i batteri in cui avevo messo la glycerol del vettore+gene, mentre quelli col vettore vuoto non sono cresciuti.. ho fatto una prova mettendo due inoculi del vettore vuoto, uno con ampicillina e l'altro con kanamicina, ma non è cresciuto niente di niente... questo potrebbe dipendere dal fatto che la glycerol è rovinata, ma dovendo ripartire da zero, che antibiotico devo mettere?!
ho trovato anche una vecchia fotocopia con la mappa del vettore, dove è disegnata la resistenza all'ampicillina, però sotto c'è scritto di trattare con ampicillina e kanamicina... però non sono sicura che la mappa sia quella del MIO vettore, e non una generica scaricata da internet...
avete consigli? vi preeeeeeego...
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SpemannOrganizer
Utente

Spemann

Città: Los Angeles


955 Messaggi

Inserito il - 30 aprile 2010 : 13:27:27  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di SpemannOrganizer Invia a SpemannOrganizer un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Mi viene da pensare che il gene per la resistenza alla kanamicina sia nell'inserto stesso, nel gene X inserito nel plasmide; il plasmide invece potrebbe avere un gene resistenza ad un antibiotico diverso (ampicillina?). Hai informazioni riguardanti l'inserto, per poter verificare?

Per sapere che resistenza abbia il tuo plasmide, puoi ricercare nella ditta fornitrice (o comunque da chi lo ha prodotto, dovrebbero avere il pdf con la mappa e tutte le info utili).
Certo è un pò buffo che i tuoi colleghi nn si siano scrtti la resistenza o non abbiano una mappa aggiornata e attendibile del vettore! comunque...

Poi la verifica delle possibili ipotesi è resa complicata dal fatto che nn sai nemmeno se gli stock glicerolo che hai siano buoni o meno.
Io direi intanto, come prima cosa, di rifarti un nuovo stock di batteri e poi trasformarli con il plasmide vuoto e verificare la resistenza.
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cami
Utente Junior

p

Città: roma


136 Messaggi

Inserito il - 30 aprile 2010 : 14:43:26  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di cami Invia a cami un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Citazione:
[i]Certo è un pò buffo che i tuoi colleghi nn si siano scrtti la resistenza o non abbiano una mappa aggiornata e attendibile del vettore! comunque...

... buffo non è proprio la prima parola che mi è venuta in mente...
comunque grazie mille, davvero, mi stai regalando uno spiraglio di luce in questo momento di disperazione acuta!!
proverò a rifare la trasformazione batterica, così almeno mi elimino qualche variabile, e poi vedremo... grazie ancora!!
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Morfeo
Nuovo Arrivato

Città: Roma


110 Messaggi

Inserito il - 30 aprile 2010 : 20:53:27  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Morfeo Invia a Morfeo un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Aspetta, se tu trasformi col vettore vuoto (si fa per controllo per vedere se la digestione del plasmide è avvenuta correttamente) digerito ti devi ritenere soddisfatta se noti su piastra pochissime colonie rispetto a quella col vettore con l'inserto, perchè vuol dire che il plasmide è stato digerito bene è rimasto lineare e non potendo richiudere su se stesso è stato degradato in E.coli quindi non hai resistenza all'antibiotico e di conseguenza c'è una crescita quasi zero.
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SpemannOrganizer
Utente

Spemann

Città: Los Angeles


955 Messaggi

Inserito il - 30 aprile 2010 : 22:22:06  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di SpemannOrganizer Invia a SpemannOrganizer un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Citazione:
Messaggio inserito da Morfeo

Aspetta, se tu trasformi col vettore vuoto (si fa per controllo per vedere se la digestione del plasmide è avvenuta correttamente) digerito ti devi ritenere soddisfatta se noti su piastra pochissime colonie rispetto a quella col vettore con l'inserto, perchè vuol dire che il plasmide è stato digerito bene è rimasto lineare e non potendo richiudere su se stesso è stato degradato in E.coli quindi non hai resistenza all'antibiotico e di conseguenza c'è una crescita quasi zero.



Giustissimo.questo è quello che ci si attende (hopefully) da una ligation. Però credo che intendesse il plasmide vuoto, prima della digestione ed eventuale subclonaggio/ligation.

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cami
Utente Junior

p

Città: roma


136 Messaggi

Inserito il - 03 maggio 2010 : 10:53:57  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di cami Invia a cami un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Citazione:
Giustissimo.questo è quello che ci si attende (hopefully) da una ligation. Però credo che intendesse il plasmide vuoto, prima della digestione ed eventuale subclonaggio/ligation.


esatto!
grazie a tutti e due!! se volete continuare a postare consigli non fate complementi!!! (sono alla continua ricerca di informazioni, quindi qualsiasi aggiunta verrà accolta con enorme entusiasmo!!!)
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SpemannOrganizer
Utente

Spemann

Città: Los Angeles


955 Messaggi

Inserito il - 03 maggio 2010 : 11:28:01  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di SpemannOrganizer Invia a SpemannOrganizer un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
non ti do consigli questa volta ma ti racconto solo che qualche giorno abbiamo avuto anche noi qualche problema con cellule che nn si trasformavano bene... il tecnico qui allora ha preparato un pò di cellule competenti (circa un 200 aliquote da 100 microlitri!)... oh sono SUPER competenti! ha fatto una trasformazione di prova con 0.1 ng di DNA... il giorno dopo ha trovato al piastra piena!

Spettacolo!
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angemore
Nuovo Arrivato



82 Messaggi

Inserito il - 03 maggio 2010 : 12:36:05  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di angemore Invia a angemore un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ciao Cami, per essere sicura che quella mappa che hai trovato sia quella del tuo vettore puoi fare una digestione con enzimi di restrizione come ti ho suggerito prima.
identifichi due enzimi che tagliano il tuo inserto e puoi fare un gel di agarosio (di solito allo 0.8% ma dipende dalla grandezza del plasmide e del vettore) in cui carichi l'uncut (non digerito), il linearizzato (cioè il digerito con un enzima di restrizione che effetua un solo taglio e ti linearizza il plasmide) e il doppio digerito che ti rilascia il tuo inserto. In questo modo controlli che:
- la mappa che hai trovato corrisponda veramente a quella che stai usando (se non ti vengono le bande che ti aspetti allora il plasmide e di conseguenza la resistenza che stai usando non sono quelle che ti aspetti)
- se c'è l'inserto (lo vedi nel doppio digerito se vedi due bande, una del plasmide e una dell'inserto che ovviamente devono trovarsi all'altezza attesa)
Una volta visto se il plasmide è quello giusto controlli su internet la resistenza (meglio non fidarsi delle cose scritte dagli altri).
Citazione:
vi è mai capitato di avere un vettore vuoto e il rispettivo vettore con un gene inserito che abbiano due resitenze diverse?

Non ho molta esperienza in merito ma sinceramente non mi spiegherei come sia possibile. Ho lavorato con vettori di espressione che hanno una doppia resistenza una portata dal plasmide con l'inserto che viene trasfettata e una già presente nel vettore di espressione ma questa è un'altra cosa.
Se si tratta come dici tu di pBABE-neo allora hai la resistenza all'ampicillina (in batteri) e alla neomicina come marker di selezione se trasfettato in cellule di mammifero...di più non so :)
spero di essere stata chiara e di non averti confuso di più le idee, fammi sapere ciao
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cami
Utente Junior

p

Città: roma


136 Messaggi

Inserito il - 20 maggio 2010 : 10:16:30  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di cami Invia a cami un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
inserisco questo messaggio non per porre altri problemi, ma per ringraziare tutti voi dei preziosi consigli e darvi un ritorno per l'aiuto che mi avete dato...
ho fatto come mi avete consigliato, cioè ho trasformato da capo i miei batteri competenti, fatto la miniprep, verificato i plasmidi e rifatto maxiprep e glycerol stock... ringraziando anche la fortuna del principiante, che ha fatto si che il tutto risultasse più facile del previsto (ero terrorizzata all'idea di sbagliare tutto e passare i prossimi 6 mesi a coltivare batteri... ), sono riuscita finalmente ad ottenere una buona resa (612 e 875 ug di plasmidi tot, yeeeee!! )
quindi grazie a tutti per il supporto, il confronto con voi è stato davvero utile!!!
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SpemannOrganizer
Utente

Spemann

Città: Los Angeles


955 Messaggi

Inserito il - 20 maggio 2010 : 11:33:30  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di SpemannOrganizer Invia a SpemannOrganizer un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
questa sì che è una buona notizia! brava!
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cami
Utente Junior

p

Città: roma


136 Messaggi

Inserito il - 20 maggio 2010 : 12:31:20  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di cami Invia a cami un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
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