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annatrippa
Nuovo Arrivato

1 Messaggi

Inserito il - 06 maggio 2010 : 14:26:32

salve, sono nuova del forum e vorrei chiedervi un consiglio.
devo fare uno screening su dei lieviti tramite pcr e volevo saper se esiste un metodo rapido per l'estrazione di dna.
grazie mille

Morfeo
Nuovo Arrivato

Citt�: Roma

110 Messaggi

Inserito il - 06 maggio 2010 : 17:41:32

Ciao, guarda ti posso scrivere il protocollo che ho usato io, non � cos� rapido, ma penso che per fare l'estrazione del dna genomico ad ogni modo un p� di tempo ci vuole. L'unica cosa ti serve un p� di materiale che non so se hai in lab, tipo le glass beads (palline di vetro, le vende la sigma).

-Centrifugare la coltura (qua ho scritto da 10mL YPD, poi dipende da che volume hai)per 5' a 3500rpm ed eliminare il supernatante (mi raccomando non lasciare capovolta la provetta come si fa per i batteri perch� il pellet di lievito � pi� delicato)
-Risospendere le cellule in 1 mL di H2O e trasferire in una eppendorf da 1,5mL
-Centrifugare 1' a 13200rpm ed eliminare il supernatante (col puntale)
-Risospendere le cellule in 200microL di Breaking buffer
-Trasferire la sospensione di cellule in una eppendorf da 1,5mL contenente 200microL di fenolo, cloroformio,alcool isoamilico 25:24:1 e 0,3 gr di glass beads (sono circa 200microL)
-Vortexare per 3'
-Aggiungere 200microL di TE
-Centrifugare 5' a 13200rpm
-Recuperare la fase acquosa e aggiungere 1mL di etanolo 100% , mettere a -20�C per 10'
-Centrifugare 10' a 13200 rpm
-Lavare con 500microL di etanolo al 70%
-Centrifugare 5'
-Asciugare il pellet a 37�C
-Risospendere il pellet in 100microL di H2O

Questa diciamo che � la versione corta, comunque per fare le pcr va benone se tu volessi fare una cosa ancora pi� pulita, ci sono altri passaggi con RNAsi, etanolo, ammonio acetato ecc.

Spero ti sia utile.