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car86
Nuovo Arrivato

Città: foggia


12 Messaggi

Inserito il - 16 maggio 2010 : 13:29:58  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di car86 Invia a car86 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
ciao a tutti.. avrei bisogno di alcuni consigli per una pcr che non mi viene.. e sono 1po sotto pressione..allora sto utilizzando una nuova taq, la fast start taq.. e ho impostato come condizioni di pcr:
95°C per 10 '
95°C per 30''
57°C per 30''
72°C per 30''
numero cicli 35
72°C per 10' per elongazione finale.
il risultato è una leggera bandina in corrispondenza del peso del mio gene, ma vedo anche delle forti bande in corrispondenza dei primers.. inoltre l'ultima volta ho trovato contaminazione nel bianco!
come posso risolvere??!!!
un'altra domanda: per verificare l'integrazione dell'mRNA devo vedere le 3bande facendolo correre sul gel d'agarosio?
spero in un vostro aiuto.. ve ne sarei grata!!
car86

domi84
Moderatore

Smile3D

Città: Glasgow


1723 Messaggi

Inserito il - 16 maggio 2010 : 15:34:13  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di domi84 Invia a domi84 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ciao Car86 e Benvenuta sul forum!
Per la contaminazione nel bianco devi stare più attenta a cambiare le punte quando cambi reagenti. Se ti ri-succede avrai contaminato qualcosa.

Per come ho capito la banda all'altezza dei primer dovrebbero essere i primer, quindi forse ne metti troppi. Ricontrolla il protocollo. Se non ricordo male devi mettere 100-150 ng di primer...
La parte del ciclo
Citazione:

72°C per 30''


è dipendente dalla lunghezza del gene: 1 min per Kbp. Il tuo amplificato è lungo circa 500 bp?
--------
Citazione:

un'altra domanda: per verificare l'integrazione dell'mRNA devo vedere le 3bande facendolo correre sul gel d'agarosio?
spero in un vostro aiuto.. ve ne sarei grata!!


eh? integrazione dell'mRNA? quale mRNA? In cosa?
Scusa, ma se non ci spieghi bene non ti possiamo rispondere


Il mio blog: http://domi84.blogspot.com/
Le foto che ho scattato...
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car86
Nuovo Arrivato

Città: foggia


12 Messaggi

Inserito il - 16 maggio 2010 : 15:48:58  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di car86 Invia a car86 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
ciao! allora..nella miscela di reazione io metto: 3microL di ciascun primer, 3microL di buffer di reazione, 3microL di magnesio, 3 microL di dNTPs e 0.5 microL di taq..e uso 2microL di cDNA..
ho un amplificato di 208 bp. la prima volta che ho usato la faststart taq non ho avuto segnale, poi modificando le condizioni ho avuto il risultato di prima, con un eccesso di primer.. domani deve assolutamente uscirmi qualcosa altrimenti la prof sclera!
per la contaminazione, sono abbastanza attenta a cambiare puntale.. ho il dubbio che mi si sia contaminato qualche reagente, non so come però.. basterà cambiare i reagenti per la mix?

per quanto riguarda l'RNA, hai ragione, mi sono espressa male.. intendevo dire valutare che l'RNA sia integro, dopo l'estrazione, e non degradato..
grazie mille!!
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domi84
Moderatore

Smile3D

Città: Glasgow


1723 Messaggi

Inserito il - 16 maggio 2010 : 18:09:39  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di domi84 Invia a domi84 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Tieni conto che dire "ho messo 3microL" stai dicendo il volume che hai messo, non la quantità. Se questi sono troppo concentrati puoi mettere una quantità eccessiva di primer. Quindi ricontrolla la quantità di primer che metti, in nanogrammi o microMoli.

Citazione:

il risultato è una leggera bandina in corrispondenza del peso del mio gene, ma vedo anche delle forti bande in corrispondenza dei primers.. inoltre l'ultima volta ho trovato contaminazione nel bianco!



Puoi vedere cosa è contaminato facendo diverse PCR di controllo in cui ognuna manca un componente:

         1  2  3  4  5
dNTP     si si si si no
Primer1  si si si no si
Primer2  si si si no si
Taq      si si no si si
Buffer   si no si si si
Stampo   no si si si si

Questo dovrebbe permetterti di identificare chi è contaminato da cosa...

Fai capire alla tua prof che le PCR si mettono a punto, per capire cosa non va...e non che ricompaiono magicamente dopo il week-end :D

Per quanto riguarda l'RNA, sì, lo devi correre su un gel di Agarosio e MOPS e vedrai 3 bande dovute alla 28S, 18S e 5S...ma qualche volta la 5S non si vede.
L'importante è che la 28S sia il doppio di intensità della 18S

Il mio blog: http://domi84.blogspot.com/
Le foto che ho scattato...
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car86
Nuovo Arrivato

Città: foggia


12 Messaggi

Inserito il - 16 maggio 2010 : 18:43:17  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di car86 Invia a car86 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
parto da una quantità di primers di 5picomol..
nella pcr che ho fatto l'ultima volta mi è stato detto di mettere un numero di cicli diverso per campione: ne erano 3, e ho impostato 35, 40 e 45 cicli..togliendo i campioni uno alla volta e poi rimettendoli per l'elongazione finale, ma per me questo procedimento non è esatto.. e il segnale era sempre più debole all'aumentare dei cicli..potrebbe essere questo il problema?
grazie ancora, sei stato molto chiaro!

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car86
Nuovo Arrivato

Città: foggia


12 Messaggi

Inserito il - 18 maggio 2010 : 11:18:45  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di car86 Invia a car86 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
ciao!!
avrei una domanda da fare: è possibile vedere se il cDNA è integro o degradato facendolo correre sul gel d'agarosio? perchè potrebbe essere degradato, o magari non è venuta la retrotrascrizione, e quindi è il motivo per cui la pcr non viene..
grazie!
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