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Discussione |
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liciageno
Nuovo Arrivato
107 Messaggi |
 Inserito il - 20 maggio 2010 : 14:38:51
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Ciao,
Ho fatto un Western blot usando come metodo di visualizzazione della banda l'ECL. Ho un problema: Analizzando l'immagine al chemidoc il segnale relativo alle bande è debole/assente. Inoltre, prendendo in mano in filtro sono chiaramente visibili delle bande dovute alla bruciatura del filtro indicando che le proteine sono ben presenti e pure in abbondanza!
La mia domanda è: Come devo fare per rimuovere la bruciatura dal filtro?
Perchè non vedo le bande al chemidoc e invece ad occhio nudo si?
Effettuando in precdenza un altro Western sulla stessa proteina non avevo problemi nel visualizzare la banda la quale era intensa, quindi è una proteina che dovrebbe venire quasi sempre.
Grazie
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Dionysos
Moderatore
Città: Heidelberg
1913 Messaggi |
Inserito il - 20 maggio 2010 : 14:44:31
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Perchè il chemidoc è una truffa! prova in camera oscura
con il vecchio metodo di sviluppo lastre. Lì vedrai la verità. |
Volere libera : questa é la vera dottrina della volontà e della libertà
(F.W. Nietzsche)
Less Jim Morrison, more Sean Morrison!
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liciageno
Nuovo Arrivato
107 Messaggi |
Inserito il - 20 maggio 2010 : 14:51:37
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| Grazie del suggerimento....l'abbiamo fatto, ma le bande sono bianche!! |
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Dionysos
Moderatore
Città: Heidelberg
1913 Messaggi |
Inserito il - 20 maggio 2010 : 15:04:53
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| "Bianche" in che senso? la lastra viene trasparente/pulita? |
Volere libera : questa é la vera dottrina della volontà e della libertà
(F.W. Nietzsche)
Less Jim Morrison, more Sean Morrison!
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cami
Utente Junior
Città: roma
136 Messaggi |
Inserito il - 20 maggio 2010 : 15:23:08
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| bianche nel senso di negative (sfondo nero e bande bianche invece del contrario)? potrebbe essere un problema di segnale troppo intenso, può capitare se si è caricato troppo campione e/o gli anticorpi sono troppo concentrati, visto che la tua proteina in precedenza aveva dato una banda intensa, potrebbe essere un problema di questo tipo... |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 20 maggio 2010 : 18:07:38
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| Non è una truffa il chemidoc, però se la membrana è bruciata (vedi le bande marroncine) vuol dire che la reazione è andata troppo avanti ed è giunta a saturazione, non riesci più a vedere le bande col chemidoc e neanche con le lastre. Il risultato è bande bianche anziché nere. Dovresti rifare il western blot diminuendo qualcosa (proteine caricate, anticorpo primaro...) in modo da non avere un segnale così forte che bruci la membrana |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 20 maggio 2010 : 18:23:11
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| Quanto tempo esponi con l'ECL? Per segnali forti io arrivavo anche a limitare il tempo di esposizione a 2-3 secondi... |
Sei un nuovo arrivato?
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My photo portfolio (now on G+!) |
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là
Utente Junior
565 Messaggi |
Inserito il - 31 maggio 2010 : 19:23:03
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a me alle volte capita di vedere al chemidoc bande negative. ha ragione GFPina: l'unica cosa che puoi fare è rifare il western. io ti suggerirei di diminuire l'anticorpo secondario |
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sir
Nuovo Arrivato
1 Messaggi |
Inserito il - 30 ottobre 2010 : 17:05:16
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| C'è una cosa che non mi fa stare tranquillo... ho ripreparato la soluzione di sviluppo come sempre, dalla stessa madre. Ho pensato potrebbe essere l'unica variabile perchè è due volte che mi vengono bande bianche su sfondo nero (le diluizioni degli anticorpi sono sempre le stesse e mi hanno sempre funzionato) non capisco quale può essere il problema... può incidere così tanto la soluzione di sviluppo o devo ripensare a sistemare le diluizioni degli anticorpi??? grazie mille |
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elly_
Utente Junior
400 Messaggi |
Inserito il - 09 novembre 2010 : 00:42:14
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Citazione:
Messaggio inserito da sir
ripensare a sistemare le diluizioni degli anticorpi??? grazie mille
quello oppure carica meno proteine
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Iside
Utente Attivo
Città: Napoli
1375 Messaggi |
Inserito il - 09 novembre 2010 : 12:52:52
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| cambia ECL. |
...we're just two lost souls swimming in a fishbawl...year after year...
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Discussione |
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Filtro Western blot bruciato
Didattica e Relazioni
