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paolo865
Utente Junior


Prov.: Como
Città: Olgiate Comasco


262 Messaggi

Inserito il - 20 maggio 2010 : 19:35:43  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di paolo865 Invia a paolo865 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ciao! Ho fatto un western su cellule trasfettate per esprimere la proteina d'interesse X. Essa è presente nelle cellule in 6 isoforme diverse, ma nel costrutto d'espressione ho la sequenza per una sola isoforma. La sequenza ha al C-term un tag 3X Flag. E' successo che quando carico le cellule rotte solo in SB noto nel blot 2 bande a MW diversi sia con l'anticorpo diretto contro la proteina X sia con l'anticorpo anti-flag, mentre se carico gli estratti proteici ho una sola banda con entrambi gli anticorpi. Perchè? Ho pensato che forse nelle cellule rotte solo in SB la mia proteina può trovarsi associata alla membrana e questo la fa migrare diversamente per qualche modifica post-traduzionale magari..secondo voi?

giulella
Nuovo Arrivato



38 Messaggi

Inserito il - 21 maggio 2010 : 09:33:47  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di giulella Invia a giulella un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Scusa l'ignoranza, ma cos'è l'SB?
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SpemannOrganizer
Utente

Spemann

Città: Los Angeles


955 Messaggi

Inserito il - 21 maggio 2010 : 12:22:24  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di SpemannOrganizer Invia a SpemannOrganizer un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
SB dovrebbe indicare sample buffer, se nn vado errato, cioè il buffer in cui viene risospeso il campione per poi caricarlo nei pozzetti. Io so che si chiama laemmli buffer, poi sai, usano sempre nomi diversi...
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SpemannOrganizer
Utente

Spemann

Città: Los Angeles


955 Messaggi

Inserito il - 21 maggio 2010 : 12:25:10  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di SpemannOrganizer Invia a SpemannOrganizer un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Comunque, per rispondere alla tua domanda... non è che se lisi le cellule in SB rompi anche le proteine? cioè in SB non ci sono inibitori di proteasi giusto? quindi forse utilizzando il semplice sb potresti provocare la frammentazione della tua proteina e vedere quindi due bande diverse...
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paolo865
Utente Junior


Prov.: Como
Città: Olgiate Comasco


262 Messaggi

Inserito il - 21 maggio 2010 : 17:42:30  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di paolo865 Invia a paolo865 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
si intendo il sample buffer o laemmli...quello che spemannorganizer dice penso sia vero però se rompessi la proteina come mai vedo bande a MW maggiore della proteina intera?
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SpemannOrganizer
Utente

Spemann

Città: Los Angeles


955 Messaggi

Inserito il - 21 maggio 2010 : 17:54:54  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di SpemannOrganizer Invia a SpemannOrganizer un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
pensavo che la banda in più fosse a peso molecolare minore della proteina intera.
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Dionysos
Moderatore

D

Città: Heidelberg


1913 Messaggi

Inserito il - 21 maggio 2010 : 18:32:05  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Dionysos  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di Dionysos Invia a Dionysos un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Scusa ma tu ti aspetti una corsa SDS-PAGE "attendibile" da un
campione lisato in un buffer che non è affatto pensato per la lisi
cellulare? ti porti dietro membrane, nuclei, genomico e quan'altro,
probabilmente sei senza inibitori delle proteasi. Hai almeno sonicato
prima di far correre su gel? Altrimenti c'è il rischio che tu veda
degli artefatti dovuti ad una cattiva corsa, che ti fanno apparire
bande apparentemente "ad alto peso molecolare" ma che magari,
molto più semplicemente, non si sono risolte bene.

Volere libera : questa é la vera dottrina della volontà e della libertà
(F.W. Nietzsche)

Less Jim Morrison, more Sean Morrison!


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paolo865
Utente Junior


Prov.: Como
Città: Olgiate Comasco


262 Messaggi

Inserito il - 21 maggio 2010 : 22:26:17  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di paolo865 Invia a paolo865 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Dionysos quello che dici l'ho pensato anche io..in realtà io ero abituato a caricare sempre gli estratti grezzi, ma nel lab dove mi trovo ora mi hanno detto di provare a fare così.
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SpemannOrganizer
Utente

Spemann

Città: Los Angeles


955 Messaggi

Inserito il - 21 maggio 2010 : 22:32:59  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di SpemannOrganizer Invia a SpemannOrganizer un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
questa pratica in realtà è abbastanza comune. L'ho rivisto fare (e l'ho fatto pure io) anche nei migliori lab... però come ti ha detto Dionysos non puoi aspettarti una grande pulizia. Ti porti appresso il DNA genomico, a meno che nn lo sonichi, ti porti appresso pure le membrane (che saranno pure disgregate dall'sds del laemmli però rimangono lì)...
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Dionysos
Moderatore

D

Città: Heidelberg


1913 Messaggi

Inserito il - 21 maggio 2010 : 23:06:56  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Dionysos  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di Dionysos Invia a Dionysos un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Io personalmente non l'ho mai visto né sentito fare,
ma credo che non lo farei sui miei campioni neanche
se mi dicessero che lo fa il migliore lab del mondo...

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Dionysos
Moderatore

D

Città: Heidelberg


1913 Messaggi

Inserito il - 21 maggio 2010 : 23:08:27  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Dionysos  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di Dionysos Invia a Dionysos un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Comunque, indipendentemente dal fatto che sia un metodo consigliabile
oppure no, sicuramente non è un metodo adatto per capire se
la tua proteina rimane associata alle membrane oppure no.

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Iside
Utente Attivo

Iside_paradise

Città: Napoli


1375 Messaggi

Inserito il - 21 maggio 2010 : 23:57:44  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Iside  Invia a Iside un messaggio Yahoo! Invia a Iside un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
in realtà, dionysos, è molto comune caricare i campioni lisando direttamente in SB. Da noi è routinario. Questo però dipende da cosa vai a vedere e dipende molto anche dalla tua proteina. io personalmente, preferisco la lisi in buffer appropriato a quella in SB, però, se devi andare solo a valutare l'espressione di una proteina per trasfezione oppure per induzione, giusto per fare due esempi, questo metodo è rapidissimo e non ti perdi nulla. va da sè che se stai caratterizzando una proteina non ti passa manco per l'anticamera del cervello di lisare in SB.
giusto per completezza, esistono delle formulazioni di SB che contengono più inibitori di proteasi e fosfatasi di un qualunque buffer di lisi :). io ne uso uno con il quale mi sono trovata bene. se interessa, posso postare la composizione.
giusto per conclude...grande Venter!!!

...we're just two lost souls swimming in a fishbawl...year after year...
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Dionysos
Moderatore

D

Città: Heidelberg


1913 Messaggi

Inserito il - 22 maggio 2010 : 00:15:03  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Dionysos  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di Dionysos Invia a Dionysos un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Si impara sempre qualcosa...comunque resto testardamente della mia idea :

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SpemannOrganizer
Utente

Spemann

Città: Los Angeles


955 Messaggi

Inserito il - 22 maggio 2010 : 10:36:08  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di SpemannOrganizer Invia a SpemannOrganizer un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Citazione:
Messaggio inserito da Iside

...giusto per completezza, esistono delle formulazioni di SB che contengono più inibitori di proteasi e fosfatasi di un qualunque buffer di lisi :). io ne uso uno con il quale mi sono trovata bene. se interessa, posso postare la composizione.
giusto per conclude...grande Venter!!!



Per esempio il powerLaemmli contiene anche inibitori di proteasi...
Ad ogni modo è meglio lisare in un lysis buffer appropriato e rimuovere porcherie varie e detriti cellulari con centrifugazioni...
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paolo865
Utente Junior


Prov.: Como
Città: Olgiate Comasco


262 Messaggi

Inserito il - 22 maggio 2010 : 11:29:34  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di paolo865 Invia a paolo865 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Iside mandami pure la composizione del tuo SB che magari provo ad usarla...cmq penso che è meglio perdere un po' di tempo in più ottenendo gli estratti che avere un segnale sporco che poi ti fa venire mille dubbi..per curiosità potreste darmi anche un protocollo per un buffer di lisi per IP?
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Iside
Utente Attivo

Iside_paradise

Città: Napoli


1375 Messaggi

Inserito il - 22 maggio 2010 : 17:59:46  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Iside  Invia a Iside un messaggio Yahoo! Invia a Iside un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
ti mando la composizione lunedì quando sono in lab!

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paolo865
Utente Junior


Prov.: Como
Città: Olgiate Comasco


262 Messaggi

Inserito il - 22 maggio 2010 : 18:17:53  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di paolo865 Invia a paolo865 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
grazie :-)
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Iside
Utente Attivo

Iside_paradise

Città: Napoli


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Inserito il - 24 maggio 2010 : 09:51:22  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Iside  Invia a Iside un messaggio Yahoo! Invia a Iside un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
allora, sample buffer 2X+ inibitori:
- sample buffer (la ricetta è in basso) 2X
- EGTA 5mM
- EDTA 5mM
- Na3VO4 2mM
- NaF 10mM
- Na-pirofosfato 10mM
- Leupeptina 10ug/ml
- Aprotinina 10ug/ml
- PepstatinaA 10ug/ml
- PAO 100uM
- beta mercaptoetanolo 10%
- PMSF 2mM
io sostituisco la leupeptina, l'aprotinina, la pepstatina A e il PAO con il cocktail di inbitori delle proteasi. Aggiungo anche un cocktail di inibitori di fosfatasi.

per il sample buffer (3X):
-TRIS HCl pH 6.8 0,375M
- SDS 15%
- Glicerolo 26,25 %
- Blu di bromofenolo quanto piace a te!

io faccio così. preparo il SB 3X e lo tengo in falcon. Poi all'occorrenza ne preparo la qantità ch emi occorre aggiungendo tutti i vari inibitori. tieni conto che questo buffer è ricco di glicerolo, quindi quando lo usi, prima di aggiungerci gli inibitori, occorre tenerlo un po' a 37°C.

spero ti sia utile!

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paolo865
Utente Junior


Prov.: Como
Città: Olgiate Comasco


262 Messaggi

Inserito il - 26 maggio 2010 : 19:44:35  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di paolo865 Invia a paolo865 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Grazie mille iside
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