Forum

Nome Utente:
Password:
Riconoscimi automaticamente
 Tutti i Forum
 Laboratorio
 Biologia Molecolare
 Estrazione DNA/RNA da linea cellulare in adesione
 Nuova Discussione  Nuovo Sondaggio Nuovo Sondaggio
 Rispondi Aggiungi ai Preferiti Aggiungi ai Preferiti
Cerca nelle discussioni
I seguenti utenti stanno leggendo questo Forum Qui c'è:

Aggiungi Tag Aggiungi i tag

Quanto è utile/interessante questa discussione:

Autore Discussione  

kiko6361
Nuovo Arrivato


Città: Verona


37 Messaggi

Inserito il - 27 maggio 2010 : 16:57:21  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di kiko6361 Invia a kiko6361 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando

Salve a tutti.
Nei prossimi giorni devo estrarre del DNA, per far fare l'analisi genetica, da una linea cellulare pancreatica che cresce in adesione.
Al di là di staccare le cellule con tripsina, ecc qualcuno di voi potrebbe suggerirmi un protocollo che vada bene al mio caso? Da quante cellule partire?
ringrazio fin da ora.

miky76
Utente Junior



126 Messaggi

Inserito il - 29 maggio 2010 : 20:00:23  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di miky76 Invia a miky76 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
ciaooo

devi tripsinare le cellule e lavarle con PBS 1X per pulirle
poi una volta lavate le centrifughi e hai di nuovo un pellet

estrai il DNA da quello come una normale estrazione di DNA

se hai un kit... usi quello

se no... nel sito ci sono 2 protocolli per estrarre DNA
e li trovi buffer di lisi

ti do le linee guida
l'idea e'
una volta ottenuto il pellet
devi lisare le cellule per far uscire il DNA
e usi un buffer lisi e di solito PK

quindi il DNA e' in soluzione
centrifughi e trasferisci la soluzione in una nuova eppendorf

e ora devi precipitare il DNA
isopropanolo o etanolo vanno bene
centrifughi e hai un pellet che contiene il tuo DNA

lavi con etanolo 70%

e poi risospendi in TE o acqua sterile

vedi i protocolli che sono sul sito

e per la quanita' di cellule un 10alla6 e' piu' che sufficiente


Torna all'inizio della Pagina

Gabry
Nuovo Arrivato


Prov.: Ancona
Città: santa maria nuova


64 Messaggi

Inserito il - 31 maggio 2010 : 13:00:18  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Gabry  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di Gabry Invia a Gabry un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
bisogna vedere per cosa ti serve il DNA. io ho provato ad estrarre il DNA con Kit e con il metodo Trizol (simile a quello che hai scritto miky76) però la resa della reazione è sempre bassa anche partendo da 10alla 6 di cellula.
ciao
Torna all'inizio della Pagina

kiko6361
Nuovo Arrivato


Città: Verona


37 Messaggi

Inserito il - 01 giugno 2010 : 14:20:00  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di kiko6361 Invia a kiko6361 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ciao e grazie delle risposte. Il trizol non va bene nel mio caso, perchè la resa è bassa. Il DNA è per fare analisi genetica, analisi di CFTR. Ho visto un protocollo su internet ma non so cosa è HIRT buffer.
Non ho soldini per un kit
tutto a manooooo
Grazie
Torna all'inizio della Pagina

kiko6361
Nuovo Arrivato


Città: Verona


37 Messaggi

Inserito il - 01 giugno 2010 : 14:22:05  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di kiko6361 Invia a kiko6361 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
io avevo visto anche questo protocollo ma le quantità in ml non mi sembrano possibili!!

http://www.riedlab.nci.nih.gov/publications/2437.2337_DNA_Prep_Adherent_cells.pdf
Torna all'inizio della Pagina

miky76
Utente Junior



126 Messaggi

Inserito il - 01 giugno 2010 : 17:24:12  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di miky76 Invia a miky76 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
ciaooo

se non hai i soldi
allora non comprare il Trizol
e' caro e per estrarre il DNA per genotipare puoi fare un buffer di lisi fatto in casa e usare PK

come descrive il protocollo che hai allegato o come suggerisce il protocollo "Estrazione DNA da code di topo" del sito

solo che se io fossi in te
se hai possibilita' di avere cellule facilmente
prima di complicarmi la vita con il passaggio fenolo/cloroformio del protocollo che hai trovato
proverei il protocollo standard per genotipare
"Estrazione DNA da code di topo"

e usi il buffer di lisi e PK del protocollo che hai

per fare una PCR non serve un enorme quantita' di DNA









Torna all'inizio della Pagina

kiko6361
Nuovo Arrivato


Città: Verona


37 Messaggi

Inserito il - 03 giugno 2010 : 11:27:51  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di kiko6361 Invia a kiko6361 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ciao il trizol ce l'ho già in casa, ma lo uso per estrarre RNA, in quanto mi hanno detto che se lo usi per il DNA la resa non è buona e il DNA fa schifo per sequenziamento.

Alla fine mi sa che opterò per questo protocollo:

http://www.protocol-online.org/prot/Protocols/Simplified-DNA-Extraction-from-Cell-or-Tissue-1157.html

mi sembra facile

GRAZIE a tutti
Torna all'inizio della Pagina

miky76
Utente Junior



126 Messaggi

Inserito il - 03 giugno 2010 : 13:10:39  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di miky76 Invia a miky76 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
ciaooo

si il Trizol e' ottimo per RNA
ma non l'ho mai usato per il DNA

e il protocollo che hai trovato e' lo stesso che uso io per estrarre
il DNA da code di topo
funziona perfettamente e mai avuto problemi per una PCR per genotipare

ma per sequenziare.... non so
magari dovrai pulire meglio il DNA
Torna all'inizio della Pagina

kiko6361
Nuovo Arrivato


Città: Verona


37 Messaggi

Inserito il - 17 giugno 2010 : 14:04:56  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di kiko6361 Invia a kiko6361 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Rieccomi qui dopo aver applicato il protocollo ho ottenuto il mio bel DNA:

Concentrazione DNA = 894,5 ng/µl

260/280 = 1,99 (260 picco DNA; 280 picco proteine)
260/230 = 2,19 (260 picco DNA; 230 contaminazioni fenoli, ecc)

L'ho fatto correre su gel d'agarosio all'1% per vedere che non fosse degradato. Il DNA è ok ma ho 2 bande ad altezza di circa 1550 e 2500. Immagino che sia RNA....confermate?

Come lo tolgo? Avete un protocollo da suggerirmi per favore?

GRAZIE
Torna all'inizio della Pagina

SpemannOrganizer
Utente

Spemann

Città: Los Angeles


955 Messaggi

Inserito il - 17 giugno 2010 : 14:37:15  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di SpemannOrganizer Invia a SpemannOrganizer un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Sei sicuro che sia RNA? se è quello direi di aggiungere delle RNasi (in genere si usa un mix RNasiA + RNasiT). Io nn ho molta esperienza di estrazione DNA genomico, ma se è in buone condizioni hai una bella banda netta che migra molto alta (nel mio caso a circa 10000 ma potrebbe essere di più)... se è degradato hai un bello smear. Non so se quelle due bande possano corrispondere a RNA.. (di RNA si vedono in genere le bande dell'rRNA 25S e 18S e, a volte, 5S ma nn ricordo a che altezza migrano, poi se non sei in condizioni denaturanti la migrazione è alterata).

Torna all'inizio della Pagina

kiko6361
Nuovo Arrivato


Città: Verona


37 Messaggi

Inserito il - 17 giugno 2010 : 15:53:55  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di kiko6361 Invia a kiko6361 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Citazione:
Messaggio inserito da SpemannOrganizer

Sei sicuro che sia RNA? se è quello direi di aggiungere delle RNasi (in genere si usa un mix RNasiA + RNasiT). Io nn ho molta esperienza di estrazione DNA genomico, ma se è in buone condizioni hai una bella banda netta che migra molto alta (nel mio caso a circa 10000 ma potrebbe essere di più)... se è degradato hai un bello smear. Non so se quelle due bande possano corrispondere a RNA.. (di RNA si vedono in genere le bande dell'rRNA 25S e 18S e, a volte, 5S ma nn ricordo a che altezza migrano, poi se non sei in condizioni denaturanti la migrazione è alterata).



Ciao SpemannOrganizer, si sono sicura che è RNA 25, 18 e 5 s . Ho la banda del DNA bella netta sopra ai 12000 e poi queste tre bendine che corrispondono all'RNA.

Ho trovato un protocollo:

Add 1ul of a 10 µg/mL (=10 ng/µL) stock solution of RNase A to your DNA and incubate at 37şC for 30 min. Recover the DNA by adding 1/10 volume of 3M sodium acetate (pH 6.8) and 2 volumes of isopropanol or 95% ethanol to the DNA containing solution. Incubate on ice for 10 min Centrifuge at maximum speed for 5 min at room temperature, to pellet the DNA. Discard (carefully) the alcohol. Wash with 70% ethanol and dry DNA. Dissolve in TE or dH2O, as you did in the DNA extraction.

la domanda è:a quanto DNA devo aggiungere quella quantità di RNAasi??

non ne vengo fuori!

grazie
Torna all'inizio della Pagina

SpemannOrganizer
Utente

Spemann

Città: Los Angeles


955 Messaggi

Inserito il - 17 giugno 2010 : 17:01:38  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di SpemannOrganizer Invia a SpemannOrganizer un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Mah... sul mio protocollo ho una concentrazione 10 volte maggiore di RNasi (100 ng/ul)ma nn è specificato a quanto DNA va aggiunta. Credo che le due cose non siano in relazione, nel senso sarebbe più logico usare una certa quantità di RNasi in relazione a una certa quantità di RNA. Tieni infine conto che l'RNasi è usata in eccesso, in modo da assicurarsi la totale eliminazione dell'RNA. Se non hai fatto questo passaggio prima, penso dovrai riestrarre il genomico per ripulirlo dalla RNasi introdotta (poi magari dipende da cosa ci devi fare).

Torna all'inizio della Pagina

ChiaraLu
Nuovo Arrivato



2 Messaggi

Inserito il - 26 gennaio 2016 : 12:06:41  Mostra Profilo Invia a ChiaraLu un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ciao Kiko6361!
Sono nuova del forum, l'ho utilizzato molte volte in realtà a livello consultivo, ma mi sono iscritta solo oggi dopo aver letto questa discussione proprio per poterti chiedere se hai risolto il tuo problema utilizzando quella RNase e seguendo quel protocollo... Ho il tuo stesso problema e sono abbastanza disperata... E' un po' vecchiotto questo post, ma spero tu possa rispondermi comunque! Nel caso replico tutto quello che hai fatto tu alla lettera!
Grazie mille!
Torna all'inizio della Pagina
  Discussione  

Quanto è utile/interessante questa discussione:

 Nuova Discussione  Nuovo Sondaggio Nuovo Sondaggio
 Rispondi Aggiungi ai Preferiti Aggiungi ai Preferiti
Cerca nelle discussioni
Vai a:
MolecularLab.it © 2003-18 MolecularLab.it Torna all'inizio della Pagina