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farmacologia
Nuovo Arrivato
100 Messaggi |
 Inserito il - 02 giugno 2010 : 08:08:19
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Salve a tutti.
Domanda facile facile per voi, problema difficile difficile per me!!!!!!!!!!!!!:(
Se tratto le mie cellule con un fitocomposto osservo una diminuizione nel'espressione di messaggero.
Da tale osservazione posso immaginare che tale composto agisca,
- direttamente, a livello trascrizionale direttamente sul gene o,
- indirettamente, attivando altre vie che portano all'inattivazione del gene.
Quali sono le metodiche biomolecolari per indagare su tali due supposti?
se avete altre supposizioni, potrete segnalarmele?
Volete aiutarmi?
grazie 1000!!!!!!!!!
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"l'unica differenza tra me e un pazzo è che io non sono pazzo!"
Salvador.Dalì
"L'unica differenza tra me e un pazzo è che io devo mentire la mia normalità per sopravvivere a questo falso mondo"
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SpemannOrganizer
Utente
Città: Los Angeles
955 Messaggi |
Inserito il - 02 giugno 2010 : 10:08:49
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Le metodiche possono essere diverse, dalla RT-PCR, alla qPCR (real time per intendersi), al northern blot del messaggero, al reporter (se hai il promotore che risponde esattamente al fitocomposto- puoi usare luciferasi o proteine fluorescenti come reporter per esempio).
Vuoi distinguere se l'azione di questo fitocromo ha effetto diretto sul gene, senza passaggi intermedi? beh, ti faccio l'esempio di Xenopus: metti caso che hai un fattore di trascrizione A che attiva (o reprime) un altro gene B, ma non sai se lo fa direttamente o indirettamente (per esempio attraverso una cascata intermedia di fattori di trascrizione). Quello che si fa è sovraesprimere una forma inducibile di questo fattore che viene tradotto ma rimane inattivo finchè non gli somministri un ormone. Prima di attivare con l'ormone inibisci momentaneamente la sintesi proteica, quindi dai l'ormone per attivare il fattore di trascrizione e poi vai ad analizzare il livello di trascritti di B (generalmente in Xenopus si fa attraverso whole mount in situ hybridization). Se il tuo fattore A agisce direttamente senza la trascrizione di altri intermedi otterrai un cambiamento nei livelli dei trascritti di B.Altrimenti questi rimarranno + o - invariati.
Credo che tu possa fare una cosa simile anche su cellule, o magari puoi pensare di vedere come cambia il livello del tuo messaggero (in risposta al fitocomposto) eliminando selettivamente fattori che potenzialmente contribuiscono alla sua regolazione.
Infine, se sospetti che un fattore di trascrizione possa legarsi direttamente al promotore del tuo gene fitocromo-inducibile, lo puoi verificare attraverso saggi di mobilità elettroforetica (EMSA) o ChIP (Chromatin ImmunoPrecipitation).
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farmacologia
Nuovo Arrivato
100 Messaggi |
Inserito il - 05 giugno 2010 : 08:38:19
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Grazie SpemannOrganizer.
Scusa se ti rispondo in ritardo, ma solo ora ho avuto la possibilità di leggere con attenzione la tua risposta.
Non ho capito quasi nulla e ciò dipende dal fatto che non conosco le metodiche da te consigliate e la loro finalità.
Mi documenterò, ma se hai protocolli dettagliati o link da consigliarmi mi faciliterai il compito.
Preciso, comunque che il trattamento lo faccio con un Fitocomposto e non con un Fitocromo. E' un estratto da una pianta i cui componenti costituiscono un pool di cui conosco, dalla letteratura, le varie frazioni.
Poichè con il trattamento osservo, attraverso una RT-PCR e succesivo gel in EthBr e una Q-PCR, una diminuizione del trascritto del gene target mi chiedevo come poter indagare sulle interazione.
La mia difficoltà consiste nel non avere una proteina o altra sostanza da taggare con un fluorocromo, ma un pool di sostanze, per osservare a che livello avviene tale controllo, positivo o negativo, nel senso:
[list] Agisce direttamente a livello del repressore attivandoloAgisce a livello del promotore, bloccandolo Agisce a livello citoplasmatico, indirettamente, attivando un pathway che promuove il repressore o blocca il promotore
e quante altre osservazioni che potete consigliarmi, per le quali non conoso le metodiche di indagine :D.
Questi sono i miei dubbi.
Grazie per avermi letto  |
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Salvador.Dalì
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SpemannOrganizer
Utente
Città: Los Angeles
955 Messaggi |
Inserito il - 05 giugno 2010 : 09:41:08
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Sì è vero, ho scambiato fitocromo per fitocomposto in alcuni casi... chiedo venia 
Senti ma tu questo fitocomposto su cosa lo usi? qual è il tuo modello sperimentale? Non so se la metodica applicata in Xenopus possa essere adatta anche per altri modelli sperimentali. provo comunque a documentarmi un pò. Se mi viene in mente qualche idea te la propongo. |
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SpemannOrganizer
Utente
Città: Los Angeles
955 Messaggi |
Inserito il - 05 giugno 2010 : 10:12:34
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Guarda, cercando un pò sulla rete ho trovato questo:
http://www.jbc.org/content/272/26/16351.full
http://www.ncbi.nlm.nih.gov.gate1.inist.fr/sites/entrez
http://www.ncbi.nlm.nih.gov.gate1.inist.fr/pubmed/20495378
I primi due utilizzano l'inibizione della sintesi proteica su cellule con cicloesimide (CHX) e poi osservano cosa succede con la trascrizione di geni target, come ti avevo detto per Xenopus.
Nel terzo sono descritte altre tecniche, come electrophoretic mobility shift assay (EMSA), chromatin immunoprecipitation (Chip) (e mi pare pure immunofluorescenza, nn ricordo), che sono le tecniche d'elite per vedere se un fattore di trascrizione regola il gene bersaglio legandosi DIRETTAMENTE al suo promotore (o meglio a degli elementi regolatori del suo promotore). A patto però che tu conosca il potenziale/i potenziali fattori di trascrizione coinvolti... |
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farmacologia
Nuovo Arrivato
100 Messaggi |
Inserito il - 05 giugno 2010 : 10:35:48
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grazie ancora.
leggerò tutto.
il modello sono le K562:D |
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Salvador.Dalì
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