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chica3


45 Messaggi

Inserito il - 04 giugno 2010 : 18:58:07  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Pin  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di Pin Invia a Pin un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Buonasera a tutti e scusate il disturbo.
So benissimo che esistono già altri thread che parlano di questo argomento, ma ho una serie di dubbi che non riesco a risolvere i suddetti.
Sto studiando una tecnica (credo che ci sia stata presentata una tecnica molto generale9 e vorrei sapere se può andare così come l'ho interpretata io.

1) Lisi cellulare
Per poter estrarre il DNA da una cellula è prima necessario rompre le strutture cellulari che lo cointengono. A tal fine sono usati Detergenti o Enzimi capaci di rompere la struttura delle membrane cellulari (e anche membrana nucleare).

2)Incubazione con Proteasi
Si filtra [è necessario anche centrifugare?] (per eliminare i frammenti membranali; ottengo in questo modo una soluzione che contiene acidi nucleici e proteine) e si aggiunge (incubazione) una proteasi: il DNA liberato infatti è legato a delle proteine che potrebbero interferire con il mio lavoro (ad esempio gli istoni con cui forma i nucleosomi). La proteasi più usata è la proteinchinasi K. Questa proteasi rompe le proteine ma anche le nucleasi (DNAsi) che tenderebbero a distruggere il DNA.

3)Rimozione delle proteine
Si effettua una estrazione con fenolo (che permette di avere la completa distruzione delle proteine) [sui miei appunti compaiono anche CENTRIFUGAZIONE IN CRADIENTE e COLONNE A SCAMBIO IONICO... Sono ciè tecniche alternative all'estrazione con fenolo? Inoltre ho letto che "migliorare" questa estrazione delle proteine viene usato anche del cloroformio?]
In questo modo si ottengono 2 fasi: una acquosa contenente il DNA ed una organica (sottostante alla precedente) contenente le proteine (questa verrà poi buttata in contenitori per rifiuti tossici).

4)Separazione della fase acquosa
Si preleva la fase acquosa e si effettua una precipitazione in Alcool del DNA: ciò viene fatto aggiungendo Etanolo (+ sale NaAc 5M). DNA e RNA vengono cioè separati sottoforma di filamenti bianchi viscosi. *

5)Si effettua un lavaggio in EtOH (75%)

6)Solubilizzazione [questa fase non la capisco]

*Per separare il DNA dall' RNA (visto che per la separazione dell' RNA si utilizza una tecnica molto simile) si sfrutta la diversa solubilità dei due acidi nucleici in etanolo con l'aggiunta di una DNAsi o RNAsi (rispettivamente se è il DNA o l' RNA l'acido nucleico non desiderato)

Quante cavolate ho detto? Quanti punti ho mal compreso?


Scusate la lunghezza del post ma sono davvero in semi-crisi.
Grazie in anticipo a tutti.


"Non è mai tardi per tentar l'ignoto. Non è mai tardi per andar oltre."

Gabriele D'Annunzio

SpemannOrganizer
Utente

Spemann

Città: Los Angeles


955 Messaggi

Inserito il - 04 giugno 2010 : 20:33:25  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di SpemannOrganizer Invia a SpemannOrganizer un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Direi che i primi due vanno abbastanza bene: al punto 2 osservo che (basandomi sui protocolli che ho usato io) non filtro ma centrifugo per eliminare i detriti cellulari. Inoltre si usa ProteinasiK e non proteinkinasiK.

Al punto 3 le tecniche di gradiente su colonna e scambio ionico sono alternative all'estrazione con fenolo, probabilmente una delle + comuni attualmente. C'è da dire che in genere l'estrazione del DNA si fa con fenolo:cloroformio. Perchè anche il cloroformio oltre al fenolo? perchè aumenta l'efficienza di denaturazione di alcune proteine che sono resistenti al fenolo (se non erro si contano delle RNasi tra queste)rimuove lipidi e migliora la separazione fase acquosa/fase organica (dove si ridistribuiscono acidi nucleici e proteine denaturate, rispettivamente).Volendo si aggiunge anche alcool isoamilico per ridurre la formazione di schiuma. Quando hai aggiunto un volume di fenolo cloroformio equivalente al vol di DNA che hai, mixi per bene e poi centrifughi (puoi anche incubare qualche minuto prima della centrifuga): la centrifugazione permette una più netta separazione di fase acquosa da fase organica.
Per essere ancora + puliti si usa riestrarre il DNA con cloroformio dopo la prima estrazione... in questo modo si eliminano possibili tracce di schifezze varie come il fenolo


4) La fase acquosa viene prelevata e gli acidi nucleici precipitati. Tu citi l'etanolo (assoluto) ma si può anche usare l'alcool isopropilico. Non sempre è possibile vedere la precipitazione del DNA (o RNA)... se è poco abbondante non vedrai nemmeno il pellet dopo la centrifugazione. generalmente dopo aver aggiunto l'alcool per la precipitazione si incuba un pò il mix (a r.t. o a -20°C) e poi si centrifuga.


5)lavaggio in EtOH al 70%


6) dopo aver lavato il DNA lo devi risospendere in acqua (o TE)... semplice. Nell etanolo nn è solubile, lo precipiti e poi lo lavi... ma per poterci lavorare lo devi risospendere in soluzione, tutto qui, non puoi mica prendere il pellet :)

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