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Andre85
Nuovo Arrivato
63 Messaggi |
 Inserito il - 05 giugno 2010 : 15:02:15
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Salve a tutti è la prima volta che scrivo ma vi seguo da molto tempo, siete utilissimi [:). In laboratorio porto avanti una ricerca sul dosaggio dell'attività di enzimi antiossidanti, Catalasi, SOD e GPX, su campioni di sangue di soggetti alcolizzati unita ad un'indagine di biologia molecolare sempre sull'espressione di geni coinvolti in questo metabolismo. L'attività la misuro sui globuli rossi; per dosare la GPX (Glutatione Perossidasi) uso un dosaggio indiretto accoppiando la reazione del'enzima in esame a quella della glutatione reduttasi che rigenera il glutatione ridotto ossidando NADPH a NADP+, il quale ossidandosi mostra un calo di assorbanza che viene visualizzato dallo spettrofotometro disegnando una retta di decremento della stessa. Da protocollo le soluzioni sono:
NADPH: 0.021 gr in 10 ml di acqua MQ
GSH: 0.031 gr in 10 ml di acqua MQ
Tampone per GPX (i dettagli al momento non me li ricordo)
H2O2: 12 microlitri 37% in 10 ml di H2O
GSH Reduttasi: 13 microlitri in 987 microlitri di Buffer per GPX
Quello che mi preme sapere è se l'enzima soffre il caldo anche se il dosaggio lo si effettua a 37 °C dopo previa incubazione della cuvetta di reazione (500 microlitri di campione + 100 di Buffer + 100 di GSH Red + 100 di NADPH + 100 di GSH) sempre a 37 °C per dieci minuti. Ieri in una giornata calda mi ha dato per la prima volta questi problemi, in pratica su 3 dosaggi dello stesso campione ho ottenuto 3 rette con pendenza diversa (mai successo) che mostravano un'incremento di attività. Grazie
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M111
Utente
Prov.: Lucca
Città: Guamo
838 Messaggi |
Inserito il - 06 giugno 2010 : 12:28:44
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Potrebbe esser una risposta ma è formulata come domanda, infatti non vorrei confondere, quindi la metto così.
Non è che il saggio dovrebbe esser eseguito a 25°C?
Per un motivo che nemmeno ricordo, forse un lab o altro...non so, ho "studiato" (ahahah) il protocollo e onestamente la prima cosa che ho pensato quando ti ho letto è stata questa...
....poi sai, io nemmeno son laureato ancora...sicchè aspetta altri.
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Andre85
Nuovo Arrivato
63 Messaggi |
Inserito il - 06 giugno 2010 : 15:07:33
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| Grazie della risposta. No da protocollo deve essere fatto a 37 °C, a 25 °C si dosa la CAT. In settimana provo a rifare gli stessi campioni climatizzando il locale e vedrò |
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Dosaggio attività GPX su RBC
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