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DNage
Nuovo Arrivato
7 Messaggi |
 Inserito il - 10 giugno 2010 : 12:01:04
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Cari ragazzi sono nuovo del forum...devo in primis complimentarmi con tutti voi che tenete vivo questo stupendo forum, sempre ricco di idee!...
In questo momento ho bisogno di voi!
Sto cercando degli interattori di una proteina fosfatasi recettoriale. Tale fosfatasi č taggata con una coda di 6 istidine in modo da purificarla dal mio lisato proteico mediante biglie magnatiche. Ora la mia domanda č: se incubo la mia proteina taggata con un pool di proteine e di queste alcune si legano, come faccio a sapere quali interagiscono?....please help me...spero di essere stato chiaro. Ho provato ad effettuare delle analisi mediante colorazione di gel di poliacrilamide con SILVER STAINING ma non riesco ad ottenere degli ottimi risultati!....
vi ringrazio tutti.
Domenico
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darkene
Utente Junior
291 Messaggi |
Inserito il - 12 giugno 2010 : 12:05:54
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spettrometria di massa o two-hybrid.
altrimenti puoi fare delle co-ip, ma devi avere un'idea su quali proteine potrebbero interagire con la tua, e soprattutto dovresti averne gli anticorpi. |
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SpemannOrganizer
Utente
Cittą: Los Angeles
955 Messaggi |
Inserito il - 12 giugno 2010 : 12:42:36
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| oppure puoi separare le tue proteine His-tagged dal tuo lisato cellulare; se c'č qualche proteina che interagisce con la tua fosfatasi rimarrą presumibilmente attaccata ad essa. poi seguono lavaggi ed eluizione della tua proteina dalle biglie magnetiche (ed insieme alla fosfatasi tutto ciņ che interagiva con essa). Per l'identificazione potresti usare bidimensionale/spettrometria di massa. Per un lavoro del genere ti occorrono un'enorme quantitą di cellule (io ho fatto una cosa analoga con cellule di Drosophila usandone circa 400 milioni!!). Inoltre devi lavorare pił che pulito altrimenti tiri gił qualsiasi cosa (e comunque anche al massimo della pulizia ci sta benissimo che tiri gił qualche interattore aspecifico). Utilizza quindi anche dei buoni controlli negativi. |
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DNage
Nuovo Arrivato
7 Messaggi |
Inserito il - 21 giugno 2010 : 17:35:05
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...bene allora quello a cui avevo pensato era corretto...Grazie mille!...
Domenico |
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DNage
Nuovo Arrivato
7 Messaggi |
Inserito il - 20 luglio 2011 : 16:03:44
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Cari ragazzi ritorno in vostro aiuto!
la spettrometria di massa ha messo in evidenza alcune proteine ma quando faccio ip non vedo molto...inoltre l'ip mi viene solo da un verso!!!! |
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theBiochemist
Nuovo Arrivato
Prov.: UK
Cittą: Leicester
14 Messaggi |
Inserito il - 21 luglio 2011 : 12:21:48
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Ciao!
Io posso dirti che nel mio laboratorio, quando utilizziamo protein G sepharose non riusciamo mai a visualizzare un'immuno-precipitazione su un Coomassie. Infatti utilizziamo una resina diversa: Anti-FLAG Agarose. Sono biglie d'agarosio covalentemente legate ad un anti-Flag M2. Con questa resina otteniamo gel molto chiari e con bande ben visibili.
Il fatto che un'IP funzioni solo da un verso puo' essere normalissimo. La posizione della tag su una o l'altra proteina puo' interferire con le superfici d'interazione delle due. Prova a cambiare la posizione della tag (N-terminale o C-terminale).
Spero possa esserti d'aiuto,
Nicola
PS
Hai provato con a fare un western? |
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lą
Utente Junior
565 Messaggi |
Inserito il - 21 luglio 2011 : 14:52:49
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Secondo me hai un buon punto di partenza per fare un pulldown e forse ovviare all'IP che fatichi ad ottenere.
in sostanza leghi la tua proteina col tag di istidina alla resina (io uso le NINTA beads). poi aggiungi il lisato e lasci in incubazione. Successivamente laverai le beads ed eluirai la tua proteina col tag di istidine e tutto ciņ che le si sarą attaccato. Poi western e rilevazione con anticorpi contro le proteine identificate con la spettrometria.
Io ora ti ho spiegato il pulldown mooooolto velocemente, ma se ti interessa fammi sapere che ti mando il protocollo. |
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theBiochemist
Nuovo Arrivato
Prov.: UK
Cittą: Leicester
14 Messaggi |
Inserito il - 21 luglio 2011 : 15:50:00
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| Scusa, lą, mi hai fatto sorgere un dubbio...intendi una cromatografia di affinita'? Anche gli IP sono dei pull-down, e sono basati sullo stesso principio di esca e preda. In piu', so che con un IP si recupera fino ad un 15-20% di proteina in piu' rispetto che con l'utilizzo di resine al nichel. Quindi il mio dubbio e'...quali sono i vantaggi una cromatografia di affinita' su una Co-IP in questo caso specifico? |
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lą
Utente Junior
565 Messaggi |
Inserito il - 25 luglio 2011 : 15:29:26
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sģ, sono entrambi dei pulldown, solo che con la resina non usi anticorpi complessati alle beads. Io ho fatto diversi pulldown per verificare diverse proteine che potessero interagire con la mia all'interno di un lisato, e i risultati sono stati soddisfacenti. ora come ora non ti sņ dire la resa, ma l'identificazione delle interazioni proteina-proteina tramite il western č stato chiaro.
Non si tratta di una cromatografia per affinitą, questa tecnica serve quando devi purificare una proteina che abbia un tag che si lega ad alta affinitą ad una resina. Il principio di base č perņ simile: tu hai la tua proteina che ha un tag e questo si lega alla resina, solo che a questa proteina poi deve legarsi un'altra proteina (se interagiscono). nella cromatografia invece a te interessa solo che si attacchi alla resina la proteina che ha il tag, per poi purificarla.
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