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Sun89
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Inserito il - 10 giugno 2010 : 12:08:18  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Sun89 Invia a Sun89 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
DETERMINAZIONE DELL' ATTIVITà b-GALATTOSIDASICA IN COLTURE DI kluyveromyces lactis CRESCIUTE IN DIVERSE FONTI DI CARBONIO.

PROTOCOLLO SPERIMENTALE PER LA DETERMINAZIONE DELL'ATTIVITà ENZIMATICA

1.Misurare l' assorbanza degli inoculi (10ml di terreno selettivo) per lunghezza d' onda = 600nm e prelevare x ml di coltura pari a 1 OD (1 OD:x OD = x ml : 1 ml). Eseguire questa operazione in doppio .
2.Centrifugare 5 minuti (12000-14000 giri a t ambiente) in eppendorf (se la quantità di coltura è elevata ripetere l' operazione).
3.Eliminare il surnatante e risospendere le cellule in 0,900 ml di TAMPONE Z + #946; mercaptoetanolo.
4.Permeabilizzare le cellule aggiungendo 0,050 mldi Cloroformio e 0,020 di SDS 0.1%.
5.Vortexare per 15 secondi.
6.Incubare a 28°C per 10 minuti.
7.Aggiungere 0.2 ml di ONPG (4 mg/ml) e agitare subito per inversione .
8.Incubare a 28° C per un minuto esatto e aggiungere 0.5 ml di Na2CO3 (1M), necessario a fermare la reazione.
9.Diluire la miscela di reazione 1:5 ponendo nelle cuvette 0.5 ml di campione e 2 ml di acqua .
10.Determinare l' assorbanza sia a 420 nm che a 550 nm. La lettura a 420 nm è una combinazione dell' assorbimento dell' o-nitrophenol e della dispersione della luce data ai residui cellulari. Una lettura dell' assorbanza a 550 nm corregge tale dispersione in quanto a questa lunghezza d' onda l' o-nitrophenol non assorbe. La dispersione della luce che si ha a 420 nm è proporzionale a quella a 550 nm:

Dispersione della luce a 420 nm = 1.75 x OD 550
L'attività #946;-galattosidasica è pari a :

1000 x((OD 420 – 1.75 x OD550)/T) x OD600

OD420 e OD550 sono letti per il mix di reazione;
OD600 è la concentrazione della sospensione cellulare(OD600 = 1);
T=tempo di reazione espresso in minuti.


CAMPIONE
ASSORBANZA A 420 nm
ASSORBANZA A 550 nm
Attività enzimatica
GLU
0.179 X 5 = 0,895
O,086 X 5 = O,43
142,5
GLU
0.148 X 5 = 0,74
0,068 X 5 =0,34
145
GLY
0.354X 5 = 1,77
0,049 X 5 = 0,245
1341,25
GLY
0.234 X 5= 1,17
0,051 X 5 = 0, 255
723,75
LAC
1.724 X 5 = 8,62
0,103 X 5 = 0,515
7718,75
LAC
1.115 X 5 = 5,575
0,092 X 5 = 0,46
4770
LAC + GLU
1.928 X 5= 9,64
0,080 X 5 = 0,4
8940
LAC + GLU
2,238X 5 = 11,44
0,096 X 5 = 0,48
10600


DOMANDE
1.Come mai si misura l' assorbanza a OD600 degli inoculi delle colture su cui effettuare il saggio per la determinazione dell'attività b-galattosidasica?
2.Perchè nella determinazione dell' attività enzimatica si sottrae il valore di assorbanza 550 nm?
3.Come si diluisce la miscela di reazione 1:5 , 1:10 , 1:20 nelle cuvette da 3 ml?
4.Spiegazione dei valori di attività b-galattosidasica ottenuti in presenza delle diverse fonti di carbonio .

GRAZIE MILLE!!!
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