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Vanilla Sky
Utente Junior




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Inserito il - 10 giugno 2010 : 15:20:55  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Vanilla Sky  Rispondi Quotando
Salve a tutti!
C'è un esercizio sulla fusione traduzionale che non riesco a capire, quindi confido in qualche suggerimento.
Se ho scritto stupidate scusatemi, non esitate a correggermi!
Ho a disposizione la mappa di restrizione di una sequenza di cDNA, nella corretta orientazione trascrizionale, con riportate le 3 possibili traduzioni.
Mi si chiede:
1.Scrivi la sequenza dei 2 primers da 20 bp che amplificherebbero esattamente la sequenza codificante.

2.In quali vettori di espressione pGEX riportati è possibile clonare il prodotto di amplificazione usando il sito dell’enzima SmaI (taglia al centro della sequenza CCC|GGG) in modo da ottenere una proteina di fusione traduzionale con la proteina GST?

Non vi ho (ancora) allegato il testo dell'esercizio perchè sono 3 pagine, e perchè spero che spaccandomi la testa con il vostro aiuto riuscirò a risolverlo.
Vi riporto la mia idea di risoluzione:
Per il primo primer fw mi cercherei innanzitutto il codone che codifica per la Met ATG, e lo farei partire da lì. Per il reverse mi cercherei un codone di stop es TAG, facendo attenzione che il senso sarà invertito dato che lo cerco sul filamento complementare. Per entrambi faccio attenzione che all'interno dei primer non ci siano codoni di stop.
Fin qui è giusto?

Per la seconda parte dell'esercizio so solo che devono scegliere il giusto vettore in modo che sia in frame...ma non ho idea di come farlo nella pratica...

Grazie 1000!!!

SpemannOrganizer
Utente

Spemann

Città: Los Angeles


955 Messaggi

Inserito il - 10 giugno 2010 : 15:59:31  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di SpemannOrganizer Invia a SpemannOrganizer un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
la prima va bene.
Per il secondo esercizio devi vedere quale è il vettore in cui, dopo averlo digerito con SmaI e idealmente clonato il tuo amplificato, la GST sia in frame con il tuo gene

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Vanilla Sky
Utente Junior




204 Messaggi

Inserito il - 10 giugno 2010 : 16:43:59  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Vanilla Sky  Rispondi Quotando
Grazie SpemannOrganizer!!
Dato che non ho ben chiaro di come impostare la seconda parte (sono un pò zuccona..sorry!) allego quello che ho fatto e le mie idee.
Per il primer fw sceglierei la prima frame, ma per il primer rv non so se scegliere la prima o la terza frame..cosa mi sfugge?
Se è giusto la frame del primer fw, sceglierei come vettore il pGEX-4T-2 e il pGEX-6P-2...se è giusto il mio ragionamento quale dei due dovrei scegliere?
Grazie ancora!!

Allegato: pGEX.pdf
23,28 KB

Allegato: esercizio.doc
22,86 KB
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SpemannOrganizer
Utente

Spemann

Città: Los Angeles


955 Messaggi

Inserito il - 10 giugno 2010 : 16:53:57  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di SpemannOrganizer Invia a SpemannOrganizer un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
non so se è un problema solo mio, ma io il file .doc nn riesco ad aprirlo... il pdf invece sì

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Vanilla Sky
Utente Junior




204 Messaggi

Inserito il - 10 giugno 2010 : 17:06:40  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Vanilla Sky  Rispondi Quotando
Ops...scusa!Sarà che il mio word è un pò vecchio, ora ho salvato nuovamente il file, spero che ora si riesca ad aprire!

Allegato: nuova versione.doc
50,01 KB
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SpemannOrganizer
Utente

Spemann

Città: Los Angeles


955 Messaggi

Inserito il - 10 giugno 2010 : 17:39:57  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di SpemannOrganizer Invia a SpemannOrganizer un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Dunque hai scelto la orf giusta, in quanto è l'unica che inizia con una Met, è la + lunga e soprattutto non è inframezzata da codoni di stop come negli altri due casi. I primer nn te li ho controllati nucleotide per nucleotide, vedo però che il primer reverse lo hai fatto partire prima del codone di stop... perchè? il codone di stop, nel filamento codificante, è più a valle è TGA, giusto?Quindi l'avrei fatto partire da lì: il reverse sarà quindi 5'->3' TCACCC. Nel tuo caso vedo che la GST rimane all'N terminale (rispetto al sito SmaI), quindi puoi decidere se lasciarci il suo codone di stop naturale o utilizzare quello del vettore d'espressione. Se però avessi dovuto fare una fusione C-terminale, in cui la GST è dopo la tua sequenza codificante, allora ha senso non includere il codone di stop, altrimenti nn avrai la traduzione della GST a valle del tuo gene, mi sono spiegato?


Per quanto riguarda la seconda domanda, mi sono basato sulla sequenza di nucleotidi/amminoacidi fornita. Questa è una sequenza consenso per taglio proteolitico (immagino che sia una sorta di tap purification: prima purifichi sfruttando la GST, poi eluisci la tua proteina tagliando con un enzima proteolitico). Detto questo, SmaI taglia nel mezzo di CCC|GGG, giusto? quindi mi sono guardato dov'è che CCC GGG sono in frame con la sequenza a monte...uno di questi vettori è pGEX-4T-2 (27-4581-01)... gli altri se ce ne sono lascio a te il trovarli :).
Spero di essere stato chiaro!

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Vanilla Sky
Utente Junior




204 Messaggi

Inserito il - 10 giugno 2010 : 17:55:22  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Vanilla Sky  Rispondi Quotando
Grazie 1000, sei stato gentilissimo e chiarissimo!!
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