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Vanilla Sky
Utente Junior




204 Messaggi

Inserito il - 02 luglio 2010 : 16:19:42  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Vanilla Sky  Rispondi Quotando
Salve a tutti!Non so se qsta è la sezione giusta per porre la mia richiesta..
Sto preparando una presentazione in cui devo illustrare l'attività di laboratorio svolta nel corso di Microbiologia e Immunologia.
Ora mi sto concentrando sul clonaggio della nostra sequenza d'interesse, a cui segue l'estrazione DNA plasmidico, Cycle sequencing, Purificazione e Analisi della sequenza con ABI Prism.
Per quanto riguarda l'estrazione del DNA plasmidico abbiamo preparato le mini boiling prep: devo esporre il protocollo utilizzato, e per non fare una presentazione tediosa, mi chiedevo se sapete se c'è su internet qualche immagine a riguardo.
Vi ringrazio in anticipo!!

Vanilla Sky
Utente Junior




204 Messaggi

Inserito il - 03 luglio 2010 : 16:32:43  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Vanilla Sky  Rispondi Quotando
Ciao!Per la richiesta qui sopra sono riuscita a risolvere!
Invece più riguardo la mia presentazione più i dubbi si moltiplicano (dubbi stupidissimi per giunta... che ora vi illustro)
Su una slide affronto l'argomento dello screening delle colonie ricombinanti, dopo che ho usato l'elettroporatore..quindi solo le cellule che avranno il plasmide formeranno colonie.
Vi illustro cm ho impostato la mia slide:

Piastramento cellule (titolo)

.Preparare una petri con 2 ml di LB agar + 2ml kanamicina (a voce spiego)
.Screening colonie: abbiamo picchiettato 9 colonie e le abbiamo fatte crescere over night
. procedere con estrazione DNA plasmidico metodo MINI BOILING PREP

Secondo voi è chiara?e soprattutto giusta?Perchè un mio amico mi ha detto che secondo lui sarebbe meglio mettere prima Screening colonie (Picchiettare 9 colonie e farle crescere over night) e poi aggiungo LB agar+ kanamicina.
Ho un altro dubbio: io sostengo che la PCR colonie l'abbiamo fatta dopo l'estrazione plasmide con il BOILING, (in cui abbiamo scelto 2 colonie. I prodotti PCR le abbiamo usate per il Cycle sequencing)..invece il mio amico pensa che abbiamo fatto lo screening colonie, fatto la PCR colonie e DOPO il mini boiling prep....

Grazie 1000!!!

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GFPina
Moderatore

GFPina

Città: Milano


8380 Messaggi

Inserito il - 06 luglio 2010 : 01:16:55  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di GFPina  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di GFPina Invia a GFPina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
mmm
secondo me on è affatto chiara.
Innanzitutto:
Citazione:
.Preparare una petri con 2 ml di LB agar + 2ml kanamicina (a voce spiego)

come hai fatto a preparare una petri con 2ml di LB agar? In genere ce ne vanno circa 20ml, sicura non fosse 20?
Poi 2ml di kanamicina, mi sembra tantissimo, ma non è indicata alcuna concentrazione, dovresti indicare la concentrazione a cui l'hai utilizzata.

Poi non si capisce bene quali sono i passaggi, in linea di massima dovresti avere qualcosa del tipo:
- preparazione petri con LB-Agar + antibiotico (kanamicina nel tuo caso)
- piastramento su petri dei batteri trasformati
- crescita delle colonie sulle piastre (in genere over night)
- "pichiettamento" (non sono sicura che in Italiano si dica così, ma se te lo hanno detto va bene, è comunque una bruttissima traduzione dall'Inglese "pick"), comunque quello che dicevi qui: "abbiamo picchiettato 9 colonie e le abbiamo fatte crescere over night"
però devi dire che le colonie che hai prelevato dalla piastra petri le hai messe in una coltura liquida di LB broth + antibiotico
- miniprep
lo schema dovrebbe essere più o meno questo.
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Vanilla Sky
Utente Junior




204 Messaggi

Inserito il - 07 luglio 2010 : 08:40:55  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Vanilla Sky  Rispondi Quotando
Grazie GFPina mi sei stata di grande aiuto!!
Ho controllato sul protocollo di LB agar ho messo proprio 2ml, invece per la kanamicina ho sbagliato io a scrivere..

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