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Biso
Nuovo Arrivato
Città: Belluno
9 Messaggi |
 Inserito il - 06 luglio 2010 : 12:23:19
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Ciao TUTTI!!
Vi scrivo per chiedervi un aiuto su come risolvere un problema legato al mio protocollo di immunofluorescenza. Il mio scopo è di marcare le proteine p53 e p21 in fibroblasti sia umani che di criceto adesi non al solito vetrino, bensì ad una pellicola detta mylar, il quale però mi produce un rumore di fondo molto forte: quando vado ad osservare il campione al microscopio a fluorescenza..vedo un campo verde (l'Ab secondario è legato a FITC) e intravedo le cellule come delle ombre..
Già nel protocollo che seguo effettuo parecchi lavaggi con PBS 1X e TRITON X100 0,1%, ma non sono sufficienti..
mi sapreste consigliare una qualche procedura?
Grazie mille in anticipo!!
ciao!
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Iside
Utente Attivo
Città: Napoli
1375 Messaggi |
Inserito il - 06 luglio 2010 : 17:12:38
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| riduci l'ab secondario sia in termini di tempo che di concentrazione. il triton ti serve solo per permeabilizzare, non per eliminare il fondo. domanda: blocchi le cellule prima di trattarle con gli anticorpi? potresti provare anche a usare un marker di nucleo così da poter vedere meglio le cellule, tipo dapi o hoechst. |
...we're just two lost souls swimming in a fishbawl...year after year...
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Biso
Nuovo Arrivato
Città: Belluno
9 Messaggi |
Inserito il - 06 luglio 2010 : 17:54:29
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Sì fisso le cellule con formaldeide al 4% in PBS1X, inoltre faccio la controcolorazione con DAPI proprio per vedere i nuclei, ma non riesco neanche a prendere delle immagini passabili in FITC intravedendo appena le cellule..
La prova che mi suggerisci non l'ho ancora fatta, quindi sarà sicuramente una delle prossime!
Grazie dell'aiuto! |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 06 luglio 2010 : 18:14:53
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| Non è che la tua membrana fluoresce in verde? In quel caso la soluzione più semplice è usare un secondario rosso. |
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Biso
Nuovo Arrivato
Città: Belluno
9 Messaggi |
Inserito il - 08 luglio 2010 : 19:07:56
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questo non lo so di preciso, so che c'è un pò di autofluorescenza come in tutte le plastiche però se fluoresca nel verde non ho informazioni.. sarebbe sufficiente guardarla al microscopio a fluorescenza usando lo stesso filtro della FITC per averne un'idea?
Grazie! |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
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Immunofluorescenza:rumore di fondo
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