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davidet
Nuovo Arrivato
44 Messaggi |
 Inserito il - 14 luglio 2010 : 13:56:16
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Ciao,
Nello specifico vi chiedo quali tecniche di biologia molecolare mi permettono di identificare i miRNA espressi ad un determinato stato di attivazione cell. (penso a come si possano identificare i miRNA nell`attivazione linfociti), lo posso vedere con la RT-PCR o ci sono delle tecniche specifiche?; inoltre per produrre una over-expression o depletion nelle cell di miRNA lo riesco a fare attraverso la costruzione di costrutti plasmidici con forti promotori o silenzianoli con ricombinazione sito specifica...., quindi in definitiva trasgenesi?. Infine per identificare il network di geni che sono regolati da un miRNA esistono dei software in silico?
Grazie
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kORdA
Utente Attivo
Prov.: Milano
Città: Monza
1303 Messaggi |
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Dionysos
Moderatore
Città: Heidelberg
1913 Messaggi |
Inserito il - 14 luglio 2010 : 21:30:45
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Citazione:
quali tecniche di biologia molecolare mi permettono di identificare i miRNA espressi ad un determinato stato di attivazione cell. (penso a come si possano identificare i miRNA nell`attivazione linfociti), lo posso vedere con la RT-PCR o ci sono delle tecniche specifiche?
Saggi di qRT-PCR con tecnologia real-time soprattutto,
ma esistono anche microRNA arrays.
Citazione:
inoltre per produrre una over-expression o depletion nelle cell di miRNA lo riesco a fare attraverso la costruzione di costrutti plasmidici con forti promotori o silenzianoli con ricombinazione sito specifica...., quindi in definitiva trasgenesi?
Troverai vettori virali per l'overespressione di miRs e vettori
"sponge", esprimenti sequenze antisenso (antagomirs) per
il sequestro dei miRNA endogeni. E' possibile fare dei topi
transgenici utilizzando lentivirus: qui ne abbiam fatti e
funzionano. E' anche possibile fare topi knockout, ma solo se
il gene del tuo miR è presente a copia singola per genoma.
Citazione:
Infine per identificare il network di geni che sono regolati da un miRNA esistono dei software in silico?
Per i network funzionali non so dirti, ma per la predizione
dei target regolati direttamente dai microRNA vedi la risposta
di Korda.
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Volere libera : questa é la vera dottrina della volontà e della libertà
(F.W. Nietzsche)
Less Jim Morrison, more Sean Morrison!
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kORdA
Utente Attivo
Prov.: Milano
Città: Monza
1303 Messaggi |
Inserito il - 15 luglio 2010 : 09:35:54
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Citazione:
Infine per identificare il network di geni che sono regolati da un miRNA esistono dei software in silico?
Bartel sostiene, in termini piu' fini, che la ricerca di network funzionali tra i target dei miRNA sia una c****a pazzesca (v. Bartel DP. MicroRNAs: target recognition and regulatory functions. Cell. 2009;136(2):215-33)
Sono d'accordo che bisogna trattare questo tipo di conclusioni con le pinze, ma confido ugualmente nelle tecniche di enrichment. Ti giro la citazione di un articolo che mi ha dato il La su questo argomento:
Gusev Y. Computational methods for analysis of cellular functions and pathways collectively targeted by differentially expressed microRNA. Methods (San Diego, Calif.). 2008;44(1):61-72
Buona lettura |
http://www.linkedin.com/in/dariocorrada |
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davidet
Nuovo Arrivato
44 Messaggi |
 Inserito il - 15 luglio 2010 : 11:42:31
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Grazie a tutti.
Piccolo particolare ma dall`estrazione del mRNA tot che ottengo come faccio a selezionarmi i miRNAs a cui far fare la qtRT-PCR?
a copia singola per genoma.
Inoltre per Dionysios
Citazione:
E' anche possibile fare topi knockout, ma solo se
il gene del tuo miR è presente a copia singola per genoma.
cosa significa?
grazie |
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Dionysos
Moderatore
Città: Heidelberg
1913 Messaggi |
Inserito il - 15 luglio 2010 : 13:08:46
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Citazione:
Piccolo particolare ma dall`estrazione del mRNA tot che ottengo come faccio a selezionarmi i miRNAs a cui far fare la qtRT-PCR?
Esiste una tecnologia Taqman che fa utilizzo di un primo hairpin
primer per la retrotrascrizione (che non risulta quindi generalizzata,
come quella che fai con i random hexamers, bensì miRNA-specifica) ed
un sistema di primers e sonde miRNA-specifici per la successiva qPCR.
Citazione:
E' anche possibile fare topi knockout, ma solo se
il gene del tuo miR è presente a copia singola per genoma.
cosa significa?
grazie
Significa che alcuni miRNA sono presenti in moltiplici copie
oppure in clusters nel genoma di alcuni vertebrati. In quei
casi non puoi - per forza di cose - fare un genetic knockout.
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