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H2O
Nuovo Arrivato
32 Messaggi |
 Inserito il - 14 luglio 2010 : 17:29:10
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Ciao a tutti, ho cominciato da poco ad utilizzare la real time e dopo varie prove con nostri primers usando SyberGreen sono arrivato a dover fare l'analisi relativa utilizzando come controllo interno la tubulina. Non essendo pratico di questo aspetto, non so bene come vanno interpretati i dati finali per poter poi valutare le differenze di espressione tra gruppi sperimentali e gruppi di controllo. Lo strumento da me usato è: Biorad c100 ThermalCycler più il modulo superiore CFX96 Real-Time system.
Ho provato a vedere diversi esempi che ci sono all'interno del programma (CFX manager) ma non mi è molto chiaro il tipo di calcolo che viene fatto dal software.
grazie 
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fideb
Nuovo Arrivato
Città: Potenza
54 Messaggi |
Inserito il - 18 luglio 2010 : 17:41:42
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| vediamo se riesco ad esserti un pò d'aiuto...io ho utilizzato uno strumento (e annesso software) dell'Applied Biosystems, non della Biorad...esso mi forniva i dati "grezzi" dei Ct e poi elaborava il tutto fornendo i livelli di espressione relativi...io però ho sempre preferito fare i calcoli da me, al max con l'aiuto di excel...se hai i valori dei Ct di tutti i geni in esame (compreso l'endogeno tubulina)per i gruppi sperimentali (per esempio malati) e quelli controllo, sottrai a questi il valore del corrispondente Ct della tubulina del gruppo considerato...hai così i dCt ...cioè, per esempio, il Ct della tubulina nel gruppo sperimentale I è 19,423 e il Ct del gene X sempre nel gruppo sperimentale I è 23,375 sottraggo a 23,375 19,423 e ottengo 3,952, il dCt del gene X per il gruppo sperimentale I…la stessa cosa va fatta per lo stesso gene per tutti i gruppi sperimentali e per tutti i gruppi controllo…quindi sottrai ai dCt dei gruppi sperimentali quelli dei gruppi controllo...hai così i ddCt...ovvero hai ottenuto un dCt pari a 3,952 per il gene X per il gruppo sperimentale e un dCt pari a 2,857 per il gene X per il gruppo controllo, sottrai a 3,952 2,857 ed ottieni così un ddCt pari a 1,095…infine eleva 2 a -ddCt...nel nostro esempio 2 elevato a -1,095 che è uguale a 0,468, quindi il nostro gene X è sottoespresso nel gruppo sperimentale rispetto al controllo e la sua espressione è pari a 0.468 volte quella del controllo…il software alla fine dovrebbe fornirti questo dato, ovvero l’espressione del gene X nel gruppo sperimentale relativamente al gruppo controllo…attenzione però nell’impostazione dell’endogeno e del riferimento (calibratore, cioè il controllo nel tuo caso)...inoltre per applicare il metodo relativo, le efficienze di amplificazione dei geni di interesse e del gene costitutivo devono essere paragonabili... |
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