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giulella
Nuovo Arrivato
38 Messaggi |
 Inserito il - 21 luglio 2010 : 15:59:42
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Ciao a tutti,
volevo chiedere qualche consgilio riguardo la tecnica di trasfezione.
Io sto cercando di abbassare il livello di espressione della mia proteina usando Lipofectamina 2000 e RNAi....ma sono due mesi che lotto con questo esperimento senza riuscire ad ottenere nessun risultato...
Inoltre, per calcolare l'efficienza di trasfezione (quando un giorno funzionerà) dovrei marcare il mio siRNA con un fluoroforo?
Grazie a tutti 
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SpemannOrganizer
Utente
Città: Los Angeles
955 Messaggi |
Inserito il - 21 luglio 2010 : 16:28:10
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per l'efficienza di trasfezione basterebbe trasfettare un costrutto che esprima GFP, per esempio cmv::GFP. Magari prova prima a trovare le condizioni ideali di trasfezione con la GFP, che è una cosa relativamente facile in quanto ti conti il numero di cellule gfp+ rispetto al totale (per esempio ti potresti contare un migliaio di cellule e su queste vedere quante esprimono gfp). Una volta che hai trovato le condizioni ottimali trasfetti il tuo RNA (cosa è un dsRNA o un costrutto codificante shRNA?).
In bocca al lupo! |
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giulella
Nuovo Arrivato
38 Messaggi |
Inserito il - 21 luglio 2010 : 16:56:19
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Grazie per la risposta
E' un dsRNA.
Quindi dovrei trasfettare prima solo la GFP e poi solo il mio RNA? In lab abbiamo dei dsRNA target per il mio gene marcati per un fluoroforo...vanno bene lo stesso?
Tu hai mai usato la lipofectamina? |
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SpemannOrganizer
Utente
Città: Los Angeles
955 Messaggi |
Inserito il - 21 luglio 2010 : 18:19:29
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Dunque io pure trasfettavo dsRNA su cellule di Drosophila. Non usavo dsRNA marcati, se li hai però credo che vadano bene lo stesso (nel lab dove sono ora usano morpholino marcati con la fluoresceina, che funzionano abbastanza bene). Per l'efficienza di trasfezione io usavo un plasmide con la GFP, ma c'è da fare un distinguo: in effetti feci un test per settare le condizioni ottimali per trasfettare plasmidi, non dsRNA, però potresti provare. Ad ogni modo, se il tuo dsRNA è marcato, potresti guardare contare le cellule fluorescenti per avere un'idea di efficienza di trasfezione. Io personalmente però userei prima un dsRNA aspecifico marcato per contare l'efficienza di trasfezione...
Per quanto riguarda la lipofectamina, usavamo un prodotto analogo distribuito dalla promega (transfast), ma ci siamo accorti che le DMEL erano altrettanto efficientemente trasfettate anche senza transfast (cioè aggiungendo il solo dsRNA al loro mezzo di cultura!!!). |
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