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moonycinzia
Utente Junior



234 Messaggi

Inserito il - 20 agosto 2010 : 09:36:58  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di moonycinzia Invia a moonycinzia un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Salve a tutti,
premetto che non ho molta esperienza di colture cellulari ma mi e´capitato comunque di lavorarci.
Sia che fossero in sospensione o aderenti le ho SEMPRE contate prima di seminarle su piastra.
Ora sono di nuovo in Danimarca e mi trovo a dover iniziare serimanete a lavorare con una linea aderente.
Ho seguito una ragazza nello scongelamento e mi ha spiegato un po´di cose sulla confluenza ecc e ho capito che qui e´routine non contare le cellule aderenti (se non strettamnente necessario) ma semplicemente splittarle quando sono a confluenza e poi calcolare la percentuale in base alla dimensione della piastra. Non credo di aver capito molto bene,o meglio mi sembrarva di aver capito al momento ma ora mi sopravvengono dei dubbi. voi sapreste illuminarmi?
Se aveste una piatra 75 a confluenza e doveste splittarla come procedereste?

domi84
Moderatore

Smile3D

Città: Glasgow


1723 Messaggi

Inserito il - 20 agosto 2010 : 10:23:02  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di domi84 Invia a domi84 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Anche qui da noi si fa così (ovviamente solo per la linea, non per gli esperimenti).
Il fatto è che non devi mai far andare a confluenza le cellule, per cui ti consiglio i primi giorni (finchè non capisci il rate di crescita delle cellule) di fare diverse diluizioni. Ci sono alcune cellule che il giorno prima stanno al 30% e il giorno dopo sono a confluenza (tipo le 293) e altre che il giorno prima stanno 50% e quello al 75%.
Queste valutazioni in percentuale si fanno occhio, tenendo conto degli spazi vuoti di una piastra.
Dicevo, parti da una piastra che ti sembra piena e semina le cellule con diluizioni 1:2, 1:4 e 1:8 così inizi a capire che rate di crescita hanno.
Magari quelle 1:2 saranno a confluenza il giorno dopo (quindi non va bene, e le butti), quelle 1:4 magari stanno al 50% e quelle 1:8 vanno a confluenza dopo 2 giorni...
...pian piano impari come crescono e non avrai più problemi.

Il mio blog: http://domi84.blogspot.com/
Le foto che ho scattato...
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moonycinzia
Utente Junior



234 Messaggi

Inserito il - 20 agosto 2010 : 11:12:53  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di moonycinzia Invia a moonycinzia un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Citazione:
Messaggio inserito da domi84

Anche qui da noi si fa così (ovviamente solo per la linea, non per gli esperimenti).
Il fatto è che non devi mai far andare a confluenza le cellule, per cui ti consiglio i primi giorni (finchè non capisci il rate di crescita delle cellule) di fare diverse diluizioni. Ci sono alcune cellule che il giorno prima stanno al 30% e il giorno dopo sono a confluenza (tipo le 293) e altre che il giorno prima stanno 50% e quello al 75%.
Queste valutazioni in percentuale si fanno occhio, tenendo conto degli spazi vuoti di una piastra.
Dicevo, parti da una piastra che ti sembra piena e semina le cellule con diluizioni 1:2, 1:4 e 1:8 così inizi a capire che rate di crescita hanno.
Magari quelle 1:2 saranno a confluenza il giorno dopo (quindi non va bene, e le butti), quelle 1:4 magari stanno al 50% e quelle 1:8 vanno a confluenza dopo 2 giorni...
...pian piano impari come crescono e non avrai più problemi.



Combinazione, proprio le HEK293!
Anche io penso che con un po´di tempo iniziero´a farci l´occhio anche se mi sembra difficile riuscire a capire la differenza fra un 30% e un 50%, mi sembra un po´empirico. Ma si sa con lésperienza...Cé´invece una relazione fra percentuale e superficie della piastra?
Mi spiego , ed e´una domanda stupida...se parto da una T75 e voglio passare ad una T 25 o una T175, come tengo conto della percentuale?.
Lo chiedo perche´la ragazza in questione, che mi ha spiegato láltro giorno ma ora non e´qui ( e offi devo spezzarle, arghhh), mi ha fatto un discorso sul fatto che quando le aveva congelate , erano a confluenza in due fiesche da 175 e che bisogna tenere in considerazione anche la superficie della piastra. (ma perche´non gliel´ho chiesto prima??)
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domi84
Moderatore

Smile3D

Città: Glasgow


1723 Messaggi

Inserito il - 20 agosto 2010 : 12:08:10  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di domi84 Invia a domi84 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Citazione:
mi sembra difficile riuscire a capire la differenza fra un 30% e un 50%, mi sembra un po´empirico. Ma si sa con lésperienza


Sì, è una cosa empirica, per questo non si possono fare gli esperimenti così

Citazione:
Cé´invece una relazione fra percentuale e superficie della piastra?
Mi spiego , ed e´una domanda stupida...se parto da una T75 e voglio passare ad una T 25 o una T175, come tengo conto della percentuale?.

Ovviamente c'è una correlazione. Le cell di una T25 a confluenza non riempie una T75. Ancora una volta, quando passo a piastre/flasche più piccole/grandi conto le cellule e faccio varie diluizioni per vedere come stanno meglio.

Citazione:
quando le aveva congelate , erano a confluenza in due fiesche da 175 e che bisogna tenere in considerazione anche la superficie della piastra. (ma perche´non gliel´ho chiesto prima??)

Spiacente, ma su questo non ti posso aiutare, non so come fanno i congeli/scongeli senza contare le cellule.
Quello che ti posso dire è che per quanto riguarda le 293:
Citazione:
An inoculum of 2 X 10 (3) to 6 X 10 (3) viable cells/cm2 is recommended.

Fonte:
http://www.atcc.org/ATCCAdvancedCatalogSearch/ProductDetails/tabid/452/Default.aspx?ATCCNum=CRL-1573&Template=cellBiology

Il mio blog: http://domi84.blogspot.com/
Le foto che ho scattato...
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moonycinzia
Utente Junior



234 Messaggi

Inserito il - 20 agosto 2010 : 12:29:51  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di moonycinzia Invia a moonycinzia un Messaggio Privato  Rispondi Quotando


Citazione:
quando le aveva congelate , erano a confluenza in due fiesche da 175 e che bisogna tenere in considerazione anche la superficie della piastra. (ma perche´non gliel´ho chiesto prima??)

Spiacente, ma su questo non ti posso aiutare, non so come fanno i congeli/scongeli senza contare le cellule.
Quello che ti posso dire è che per quanto riguarda le 293:
Citazione:
An inoculum of 2 X 10 (3) to 6 X 10 (3) viable cells/cm2 is recommended.

Fonte:
http://www.atcc.org/ATCCAdvancedCatalogSearch/ProductDetails/tabid/452/Default.aspx?ATCCNum=CRL-1573&Template=cellBiology

[/quote]

Per me sarebbe meglio contare, alla fine oggi la ragzza viene, quindi splitteremo insime...mha!
Grazie per le info!
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Daria85
Utente

aplisia



678 Messaggi

Inserito il - 01 settembre 2010 : 21:29:32  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Daria85 Invia a Daria85 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
io uso delle linee di epatocarcinomi, ma cmq il criterio è lo stesso per tutte le cellule in adesione: una volta che hai imparato a "conoscere" la linea (ossia il dubling-time) poi ti regoli di conseguenza!
io per esempio, in una T75, quando sono a confluenza stacco, e dopo aver neutralizzato la tripsina prelevo 2-3ml, li metto in una nuova fiasca e porto a volume di circa 15ml. così son tranquilla che almeno per 2-3gg non devo passarle!
in ogni caso di solito la confluenza ottimale è circa 150.000\cm^3!

se per esempio voglio congelare, pellettizzo tutte le cellule che ho, valuto il pellet, e vedo se usare 1,2 o 3 criovial!

se invece vuoi trasferire da una T75 a una fiasca grande, basta che :
-o le stacchi tutte, e le trasferisci tutte nella fiasca grande con del terreno nuovo, poi il giorno dopo vedi come sn cresciute
-o baste che dopo averle staccate ne passi metà nella nuova fiasca.

spero di averti dato qualche info utile!

baci
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Gst
Utente Junior


Prov.: Roma
Città: Ariccia


143 Messaggi

Inserito il - 11 settembre 2010 : 17:23:27  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Gst Invia a Gst un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Per quanto riguarda il passaggio da una piastra ad un'altra, cambiando la grandezza della pistra, io mi regolo calcolando la differenza di area della piastra di partenza rispetto a quella in cui devo passarele cell:

es. se ho le cell in una piastra da 10 cm e so che le passerei 1:6 se dovessi metterle in una piastra da 10 cm nuova. Nel caso in cui invece le devo passare da una pistra da 10 cm a una piastra da 6 cm le metterei, invece di 1:6, 1:15! questo perchè il rapporto tra l'area di una pistra da 10 cm e quella di una da 6 è poco + di 2, quindi moltiplico la diluizione che avrei fatto (1:6) per il rapporto delle aree.

Così mi son sempre trovata bene!

Ti assicuro ke è molto + facile a farsi ke a dirsi

Ascoltami con gli occhi...
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