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 Primers mutagenici per PCR
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CRLM
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Inserito il - 30 agosto 2010 : 12:18:34  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di CRLM Invia a CRLM un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Buongiorno!!!!
Qualcuno potrebbe provare a spiegarmi come sintetizzare(ovvero scrivere a mano) primer mutagenici per PCR?
Questo è un es. di una prova d'esame:
Scrivere le sequenze di due oligonucleotidi mutagenici per la sostituzione tramite PCR della leu in ser
(TCG) nella sequenza
5’ACG ATC TTT GGC GAG CTG GCG GGC AGC 3’
  thr ile phe gly glu leu ala gly ser

interna ad un gene clonato
Ringrazio già chi proverà a rispondermi

adrez
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10 Messaggi

Inserito il - 30 agosto 2010 : 15:20:09  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di adrez Invia a adrez un Messaggio Privato  Rispondi Quotando

5'-------------acg-atc-ttt-ggc-gag-CTG-gcg-ggc-agc---------------3'
3'-------------tgc-tag-aaa-ccg-ctc-GAC-cgc-ccg-tcg---------------5'


questa è la sequenza del gene sulla quale devi costruire i 2 primer per la sostituzione della leu(CTG) in ser(TCG).

5'-------------acg-atc-ttt-ggc-gag-CTG-gcg-ggc-agc---------------3'
            3'-tgc-tag-aaa-ccg-ctc-AGC-cgc-ccg-tcg-5'

            5'-acg-atc-ttt-ggc-gag-TCG-gcg-ggc-agc-3'
3'-------------tgc-tag-aaa-ccg-ctc-GAC-cgc-ccg-tcg---------------5'


I due primer sono:

1)5'-acg-atc-ttt-ggc-gag-TCG-gcg-ggc-agc-3'
2)3'-tgc-tag-aaa-ccg-ctc-AGC-cgc-ccg-tcg-5'



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CRLM
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20 Messaggi

Inserito il - 30 agosto 2010 : 15:38:48  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di CRLM Invia a CRLM un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
cioè scrivo l'elica complementare, mi riscrivo le due eliche con la tripletta codificante LEU già mutata in modo che poi codifichi per SER e sintetizzo i primers complementari?senza calcolare temperatura di annealing nè nient'altro?!
grazie mille!!!
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adrez
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10 Messaggi

Inserito il - 30 agosto 2010 : 16:00:28  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di adrez Invia a adrez un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
1)cioè scrivo l'elica complementare, mi riscrivo le due eliche con la tripletta codificante LEU già mutata in modo che poi codifichi per SER e sintetizzo i primers complementari? esatto!

2)senza calcolare temperatura di annealing nè nient'altro?!la temperatura di annealing non ti serve per determinare la sequenza dei primer. I primer non vengono disegnati in funzione della temperatura di annealing. Di solito queste pcr vengono condotte in condizioni di bassa stringeneza in modo da favorire il legame di primer non perfettamente complementari alla sequenza bersaglio
-se non ti è chiara qualcosa chiedi pure-
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CRLM
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20 Messaggi

Inserito il - 30 agosto 2010 : 16:05:12  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di CRLM Invia a CRLM un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Citazione:
Messaggio inserito da adrez
[-se non ti è chiara qualcosa chiedi pure-


no no, ho capito bene grazie!
finalmente!!!!!!!!!
sei stato di grande aiuto!!!
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GFPina
Moderatore

GFPina

Città: Milano


8380 Messaggi

Inserito il - 31 agosto 2010 : 11:43:29  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di GFPina  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di GFPina Invia a GFPina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Nota: Ho modificato i messaggi per renderli più chiari (e quindi cancellato i doppioni) , se volete fare in modo che il testo che scrivete rimanga allineato utilizzate il tag code:
[code ]...[/code]
quello che viene scritto in mezzo rimane allieato come lo avete scritto.

Qua trovate l'elenco dei tag disponibili: http://www.molecularlab.it/forum/faq.asp#format
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