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_pietro_
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 Inserito il - 07 settembre 2010 : 14:36:51
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Ciao a tutti,
ritorno dopo una lunga assenza con un nuovo problema:
Coltivo retine di topo per lo studio di una proteina di membrana che viene tagliata da proteasi e rilasciata nei fluidi extracellulari, in circolo ecc. Io sto cercando di individuarla nel medium, quindi l'ho salvato, fatto diverse Falcon Tubes e pronte per essere analizzate in western blot. Il problema non da poco e' che il terreno di coltura e' pieno zeppo di BSA e si da il caso che anche la mia proteina si attesti a quel peso molecolare 8per quanto questo possa sembrare secondario). Quello che volevo fare era sbarazzarmi in qualche modo del BSA. Conoscete qualche modo? Tipo precipitarlo, delle colonnine apposite o qualsiasi altra cosa...
Grazie mille
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fasalia
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Inserito il - 07 settembre 2010 : 14:44:02
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| Eh! si bel !anche io ho avuto molti rompicapo con una proteina di membrana a causa del terreno che utilizzavo. Hai pensato invece di eliminare il BSA di immunoprecipitare la tua proteina? così sei sicuro che vedi solo lei è basta. ormai tanto gli anticorpi per WB sono anche per IP |
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_pietro_
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Città: Lund
104 Messaggi |
Inserito il - 07 settembre 2010 : 14:59:29
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Questa potrebbe essere un ottima cosa da fare in seguito, ma la proteina viene si' secreta in altri organi (ma non tutti), nulla si sa in retina. Quindi mi diventa un esperimento molto costoso e alla cieca. Prima di tutto devo accertare che la proteina venga davvero secreta dalla retina (chiedo scusa per non averlo scritto prima, ma sto lavorando e scrivo nei ritagli di tempo)
;) grazie |
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fasalia
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5 Messaggi |
Inserito il - 08 settembre 2010 : 10:36:49
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Ciao, si anche io posso scrivere nei ritagli di tempo. Cmq IP è costoso davvero e se nn sei neanche certo che la proteina che cerchi c'è davvero diventa ancora più dispendioso. In particolare che proteina stai studiando? potresti provare ad usare le collonine ad affinità (ci sono dei kit anche per campioni liquidi come il tuo)e poi un immoblotting , anche perchè se vai in WB e hai il BSA alla stessa altezza chi ti esclude che non stai prendendo un abbaglio! Oppure potresti identificarla con l'mnr..ma se è costoso IP non ti dico il maldi-tof però sai davvero che la proteina è quella che cercavi.
ciao buon lavoro |
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_pietro_
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Inserito il - 08 settembre 2010 : 11:17:41
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Si', in effetti rovistando un po' in rete ho beccato delle colonnine della Amersham (HiTrap Blue HP se non sbaglio).
Cito testualmente:
The nature of Blue Sepharose™ High Performance makes it a very
versatile tool for the separation of many proteins e.g. enzymes
requiring adenylcontaining cofactors (including NAD+ and NADP+),
albumin, coagulation factors and interferon. The ligand is a dye,
Cibacron™ Blue F3G-A, which is covalently attached to the highly
cross-linked agarose medium via the triazine part of the dye
molecule.
Sperando che non mi becchi anche la mia (che e' una proteina di membrana che agisce come cofattore per gli FGF e FGFR), direi che e' la scelta giusta e sara' presto ordinata...
Tack så mycket |
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Sbarazzarsi del BSA
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