Forum

Nome Utente:
Password:
Riconoscimi automaticamente
 Tutti i Forum
 Laboratorio
 Biologia Molecolare
 Fill in
 Nuova Discussione  Nuovo Sondaggio Nuovo Sondaggio
 Rispondi Aggiungi ai Preferiti Aggiungi ai Preferiti
Cerca nelle discussioni
I seguenti utenti stanno leggendo questo Forum Qui c'è:

Aggiungi Tag Aggiungi i tag

Quanto è utile/interessante questa discussione:

Autore Discussione  

Vars
Nuovo Arrivato



44 Messaggi

Inserito il - 15 settembre 2010 : 18:48:39  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Vars Invia a Vars un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ciao...vorrei chiedere una cosa...potreste spiegarmi perchè in un esperimento di clonaggio genico è preferibile usare enzimi di restrizione che tagliano blunt o che tagliano sticky, quali sono i vantaggi e gli svamtaggi di usare uno o l'altro tipo. E poi vorrei sapere come si rapporta la risoluzione di problemi derivanti dall'uso dell'uno o dell'altro tipo di enzima con la tecnica del fill in, questa è stata una domanda che ho sentito posta ad un esame, quind probabilmente ho capito male io, ma comunque sono sicura che nel discorso sugli enzimi di restrizione si sia parlato di fill in, qual è la relazione?
grazie in anticipo!

Fujiko1986
Nuovo Arrivato

Prov.: Varese


8 Messaggi

Inserito il - 15 settembre 2010 : 19:05:38  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Fujiko1986 Invia a Fujiko1986 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
ciao!! Una proprietà importante delle estremità coesive è che quelle prodotte dallo stesso enzima, anche su molecole diverse, sono complementari ( o sticky cioè appiccicose) e quindi in grado di appaiarsi l'una con l'altra. Ciò significa che un enzima di restrizione usato su un plasmide e su un frammento di Dna genera estremità complementari che possono essere unite da una ligasi a formare un vettore che potrà poi essere clonato!
Torna all'inizio della Pagina

Fujiko1986
Nuovo Arrivato

Prov.: Varese


8 Messaggi

Inserito il - 15 settembre 2010 : 19:06:38  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Fujiko1986 Invia a Fujiko1986 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
sinceramente la tecnica del fill in non so cosa sia!! ciaoooooo
Torna all'inizio della Pagina

SpemannOrganizer
Utente

Spemann

Città: Los Angeles


955 Messaggi

Inserito il - 15 settembre 2010 : 19:25:48  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di SpemannOrganizer Invia a SpemannOrganizer un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
il fill-in consiste nell'impiego di una polimerasi (generalmente la T4 polimerasi o la klenow) per "riempire" il tratto a filamento singolo di DNA lasciato da une enzima di restrizione 5' overhang (cioè che lascia estremità 5' sporgenti). Se ora metti la polimerasi, essa risintetizza il pezzetto di filamento sottostante mancante, generando estremità piatte (o blunt).
Es:

5'TAAT 3'
(HO)TA 5' ----->

(T4pol)
5'TAAT 3'
3'ATTA 5'



Questo è molto utile quando vuoi clonare un determinato inserto, in un determinato vettore, e non puoi utilizzare enzimi che generano estremità coesive uguali (o meglio complementari) o enzimi che generano direttamente estremità piatte.


Torna all'inizio della Pagina

Vars
Nuovo Arrivato



44 Messaggi

Inserito il - 15 settembre 2010 : 20:05:50  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Vars Invia a Vars un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
spemmanorganizer grazie per la risposta! ma è possibile usare questa tecnina per prevenire la formazion di molecole aberranti che possono derivare da tagli con enzimi blunt?
Torna all'inizio della Pagina

SpemannOrganizer
Utente

Spemann

Città: Los Angeles


955 Messaggi

Inserito il - 15 settembre 2010 : 21:09:40  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di SpemannOrganizer Invia a SpemannOrganizer un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
cosa intendi per molecole aberranti?

Torna all'inizio della Pagina

Vars
Nuovo Arrivato



44 Messaggi

Inserito il - 15 settembre 2010 : 21:33:51  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Vars Invia a Vars un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
quelle che si richiudono su se stesse, oppure che sono state inserite nella direzione sbagliata o che si associano in tandem testa coda...questo tipo di molecole si generano più facilmente se si usano enzimi blunt? perchè anche tagliando con enzimi diversi, possono lo stesso assemblarsi tra di loro...invece se riempio le estremità cn il fill in in modo da creare estremità stick non complementari, così che il mio dna possa inserirsi nel vettore scelto e nella direzione giusta, posso evitare la formazione di qst molecole nn desiderate?
nn so se qst mia ipotesi sia giusta, potrei aver detto delle cose che nn hanno senso, correggimi se sbaglio!
Torna all'inizio della Pagina

SpemannOrganizer
Utente

Spemann

Città: Los Angeles


955 Messaggi

Inserito il - 15 settembre 2010 : 21:42:29  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di SpemannOrganizer Invia a SpemannOrganizer un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
no, credo che tu abbia fatto un pò di confusione. E' proprio con gli enzimi blunt e con il fill-in che c'è il rischio di richiudere il vettore su se stesso (ricircolarizzazione). Lo stesso può succedere usando enzimi di restrizione che generano estremità sticky uguali. Questo spiacevole inconveniente può essere evitato, o quantomeno ridotto, con l'uso di fosfatasi alcalina.
Invece usando enzimi che generano estremità diverse, non essendo queste complementari,non potrai avere ricircolarizzazione del vettore su se stesso.

Chiaro?

Torna all'inizio della Pagina

Vars
Nuovo Arrivato



44 Messaggi

Inserito il - 15 settembre 2010 : 22:26:13  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Vars Invia a Vars un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
sisi il fatto che il rischio che la molecola rischi di richiudersi su se stessa usando enzimi blunt o gli stessi enzimi sticky mi era chiaro, forse nn m sn espressa bene prima...non mi era chiaro se è possibile usare la tecnica del fill in per aggiungre estremità non complementari...però dalla tua spiegazione evinco il contrario e quindi credo che non si possa fare, perchè tu stesso/a hai detto che questa tecnica si usa proprio quando non ho enzimi blunt o quando genero estremità coesive non complementari..grazie per la disponibilità!
Torna all'inizio della Pagina
  Discussione  

Quanto è utile/interessante questa discussione:

 Nuova Discussione  Nuovo Sondaggio Nuovo Sondaggio
 Rispondi Aggiungi ai Preferiti Aggiungi ai Preferiti
Cerca nelle discussioni
Vai a:
MolecularLab.it © 2003-18 MolecularLab.it Torna all'inizio della Pagina