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Vars
Nuovo Arrivato
44 Messaggi |
 Inserito il - 16 settembre 2010 : 17:51:19
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ciao, c'è qualcuno che può spiegarmi come allestire i diversi tipi di ligation e perchè si parla di soluzione molare nell'allestirle.
Perchè poi devo allestire reazioni in cui è presente solo vettore, solo l'inserto e solo acqua, sali ed enzima, a cosa mi servono queste reazioni, quali sono i risultati che dovrei aspettarmi e cosa mi fanno capire? Grazie
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SpemannOrganizer
Utente
Città: Los Angeles
955 Messaggi |
Inserito il - 16 settembre 2010 : 20:36:35
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Più che di soluzione molare si parla di rapporto molare. Nel fare un clonaggio, è importante riuscire a stabilire a quante moli corrisponde una data quantità di DNA, o meglio ancora quanti ng (generalmente è il nanogrammo l'unità di misura usata nel clonaggio)devi prendere di vettore e di inserto perchè siano in un rapporto molare 1:3 per esempio. E' molto + utile parlare in questi termini, al fine di organizzare un buon clonaggio con la giusta quantità di inserto e vettore, piuttosto che partire direttamente dai ng di uno e dell'altro (che da soli non ti dicono granchè).
Le altre reazioni che metti su sono dei controlli:
1)Il solo vettore (con la ligasi): è stato defosforilato appropriatamente? La digestione doppia ha funzionato efficientemente? Se sì, il vettore non si richiuderà su se stesso e quindi non ti darà background (niente colonie, tutt'al + minime)
2)solo vettore senza ligasi: è possibile che non tutto il vettore sia stato digerito, quindi questo controllo ti permette di stabilire se ti stai portando dietro uncut vector, che ovviamente può trasformarti i tuoi batteri e darti background (per background intendo colonie negative, cioè che nn hanno l'inserto che ti interessa).
3)solo inserto: generalmente viene fatto solo se hai amplificato (o escisso) un inserto dal vettore originario senza poi purificarlo da gel. Questo controllo ti dice quindi se ti stai portando dietro un altro rompipalle: il vettore originario dell'inserto.
4)Altro controllo possibile è la piastra con batteri non trasformati, quindi batteri che non possono avere resistenza per l'antibiotico prescelto: ti serve a sapere quanta contaminazione c'è stata tra un passaggio e l'altro, quanto sei stato zozzo.
Tieni conto che il numero di questi controlli può essere ridotto se sei "pulito" a priori: per esempio se purifichi dal gel il tuo inserto puoi evitare di fare il controllo n°3. Se sei sicuro, dopo una CORRETTA analisi su gel, che il tuo vettore è COMPLETAMENTE digerito puoi saltare anche il controllo 2.
Saluti
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Vars
Nuovo Arrivato
44 Messaggi |
Inserito il - 16 settembre 2010 : 22:11:37
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| Graziee!!:D |
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