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CRISTIAN
Nuovo Arrivato



92 Messaggi

Inserito il - 08 settembre 2006 : 17:21:16  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di CRISTIAN Invia a CRISTIAN un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ciao, sto effettuando degli esperimenti di clonaggio. possiedo un plasmide di espressione pET21a(estratto con maxi prep da batteri)e vorrei, partendo da questo, estrarre il frammento del gene di interesse e inserirlo in un vettore pcDNA3 per la successiva trasfezione in mammiferi. ho letto che generalmente non si estrae il gene partendo dal pET21a..ma per esempio dal puC18..che dite? posso provare lo stesso o questo mi crea dei problemi? come faccio a sapere poi se si è inserito correttamente? Se qualcuno sa rispondermi anche a solo una delle domande vi ringrazio moltissimo

GFPina
Moderatore

GFPina

Città: Milano


8380 Messaggi

Inserito il - 08 settembre 2006 : 17:47:45  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di GFPina  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di GFPina Invia a GFPina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
In genere da qualunque vettore puoi estrarre il frammento che ti interessa e clonarlo in un'atro, basta avere gli enzimi adeguati!
Ma tu hai letto proprio che non si estrae il gene da pET21a???
La cosa mi sembrerebbe strana!
Non ho mai utilizzato il plasmide pET21a, ma ho cercato una mappa su internet e non mi sembra che abbia niente di strano.
Secondo me non dovresti incontrare particolari problemi, scegli solo gli enzimi di restrizione più adeguati.
Per sapere se si è inserito correttamente:
primo se scegli due enzimi di restrizione diversi per le 2 estremità il frammento non si può inserire al contrario e poi per analizzarlo basta una PCR, possibilmente con primers disegnati nel punto in cui si dovrebbe inserire il frammento (sequenza che comprenda un pezzo di vettore e un pezzo di gene!)

Ciao
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Anyra
Utente Junior

Anyra

Prov.: Pesaro-Urbino
Città: Saltara


212 Messaggi

Inserito il - 18 settembre 2006 : 16:19:38  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Anyra Invia a Anyra un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Forse secondo me pià che la natura del plasmide io farei caso alla natura dell'ospite.
Alcuni degli E. coli utilizzati per la produzione di proteine ricombinanti hanno anche altri vettori (per es BL21 pLyss ecc) che ti porti dietro con un'estrazione plasmidica.
Potresti cosè avere delle contaminazioni

Il mio Cavaliere
http://s4.battleknight.it/index.php?loc=hire&ref=OTA3NTAw
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