| Autore |
Discussione |
|
|
Carla83
Nuovo Arrivato
19 Messaggi |
 Inserito il - 24 settembre 2010 : 14:57:46
|
ciao a tutti...
io dovrei sequenziare le mie miniprep per verificare se il clonaggio è avvenuto in maniera corretta....però non riesco! uso 500 ng di miniprep e faccio direttamente la reazione di sequencing senza passare per la PCR di base. Può essere che qualche residuo di reagenti utilizzati durante l'estrazione interferisca con il sequenziamento? Avete suggerimenti? Purtroppo non posso fare prima la PCR perché l'esone che devo controllare si amplifica molto difficilmente (1 volta sì e 10 no in pratica)....
|
|
|
|
|
bmind77
Nuovo Arrivato
Prov.: AQ
Città: L'Aquila
3 Messaggi |
Inserito il - 24 settembre 2010 : 15:59:56
|
Dovresti indagare su:
1)Avviene la reazione di sequenziamento??? (magari non hai prodotto dalla reazione)
2)Il metodo che utilizzi per purificare e precipitare il prodotto della reazione di sequenziamento (magari ti perdi il dna in questo passaggio)
3)Nel caso non vi siano problemi nei precedenti passaggi provare a diluire il tuo campione ( che dovresti avere in 20 ul di formammide ) nel modo seguente: prendi 5 ul dai 20 ul e li diluisci in 15 ul di formammide) e rimandi il sequenziatore.
|
 |
|
|
Carla83
Nuovo Arrivato
19 Messaggi |
Inserito il - 24 settembre 2010 : 16:16:47
|
Innanzitutto ti ringrazio per la risposta...allora....il dato grezzo dell'elettroferogramma non è piatto, questo mi fa pensare di non aver perso il pellet durante la purificazione (che faccio in etanolo), e oltrettutto le altre sequenze che non siano quelle di plasmidi mi vengono bene...dici che può essere un problema di quantità? io ho usato 4 microlitri di purificato + 16 di acqua (non usiamo formammide qui), anche se ho provato anche con 1 + 19....scusa la domanda da ignorante, ma come posso verificare se la reazione di sequenziamento è avvenuta? si vede su gel?.
[/quote] |
|
|
|
bmind77
Nuovo Arrivato
Prov.: AQ
Città: L'Aquila
3 Messaggi |
Inserito il - 24 settembre 2010 : 17:20:22
|
In effetti non si può vedere direttamente, ma potresti intuirlo in base all'elettroferogramma. Se non hai segnale e molto rumore di fondo dovuto ai ddntp potrebbe non essere avvenuta la reazione.
Prova a prendere dai 20ul (4ul+16ul) 5 ul e mettili in 15ul di acqua e poi fai di nuovo il sequenziamento.
Per la purificazione usi solo etanolo?? io aggiungo 2,5 volte il volume del campione di etanolo e 1/10 del volume di Acetato di Sodio 3M ph=5.2
Metto a -80°C per 1 ora o O/N a -20° (oppure 15 min in ghiaccio secco)
Poi centrifugo 30 min, elimino il surnatante,aggiungo una quantità di etanolo 70% (di solito 100ul), centrifugo per 5-10 min e poi elimino il surnatante e essicco fin quando l'etanolo evapora tutto.
Poi risospendo in 20 ul di formammide e metto a bollire per 5 min. ( va beh ma tu questo passaggio lo farai con acqua) |
|
|
|
Carla83
Nuovo Arrivato
19 Messaggi |
Inserito il - 24 settembre 2010 : 19:30:39
|
sì uso solo etanolo...etanolo assoluto circa il doppio del volume della reazione, poi lascio preferibilmente o/n a -20, centrifugo 20min, elimino l'etanolo e poi aggiungo 250ul di etanolo al 70%, centrifugo 10 minuti, elimino l'etanolo ed essico...poi risospendo in 20ul di acqua....provo a fare come suggerisci tu allora! Grazie  |
|
|
|
bmind77
Nuovo Arrivato
Prov.: AQ
Città: L'Aquila
3 Messaggi |
Inserito il - 28 settembre 2010 : 01:13:22
|
| Prego...speriamo che vada tutto bene...:) |
|
|
| |
Discussione |
|
miniprep
Didattica
