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delangelle
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 Inserito il - 26 settembre 2010 : 10:58:53
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Salve,mi sono appena iscritta al forum,ho delle domande da farvi,spero di avere risposta da qualcuno.Ho un problema,allora il mio prof mi ha fatto eseguire una RT-PCR (da cui ricavo il mio cDNA),poi ho fatto l'elettroforesi su gel d'agarosio e ho ottenuto 2 bande una da 700 una da 300 bp(marker 1 kb),ho estratto queste bande dal gel e ho avviato la procedura di clonaggio usando il vettore pGem T-Easy.Ora però l'inserto che ho usato nel clonaggio è 500 bp,io purtroppo non sono sicura di aver capio bene..perchè usiamo l'inserto di 500 bp se le bande ottenute sono da 700 e 300 bp?Io ho notato guardando l'elettroforesi che le due bande ottenute si trovano tra la banda del marker di peso molecolare di 500 bp.E'questo il motivo? O c'è qualche altro motivo?Lo scopo di tutto ciò è clonare la regione codificante della relaxina.Quindi dopo il clonaggio io ho eseguito una digestione con l'enzima EcoR-I al fine di escindere l'inserto dal vettore,ma nella digestione c'è una banda in più di 600 bp,(che non doveva esserci)quindi c'è stata probabilmente una contaminazione?Giusto? Poi il mio prof mi ha dato la sequenza codificante con esoni e oligo.Ho un dubbio la sequenza codificante che mi ha dato è quella clonata e come si ricava? E' una cosa diversa se parliamo di sequenziamento? Scusate ma ho molti dubbi e spero che qualcuno riesca a rispondermi.Vi ringrazio in anticipo.
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