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delangelle
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3 Messaggi

Inserito il - 26 settembre 2010 : 11:17:57  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di delangelle Invia a delangelle un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Salve,mi sono appena iscritta al forum,ho delle domande da farvi,spero di avere risposta da qualcuno.Ho un problema,allora il mio prof mi ha fatto eseguire una RT-PCR (da cui ricavo il mio cDNA),poi ho fatto l'elettroforesi su gel d'agarosio e ho ottenuto 2 bande una da 700 una da 300 bp(marker 1 kb),ho estratto queste bande dal gel e ho avviato la procedura di clonaggio usando il vettore pGem T-Easy.Ora però l'inserto che ho usato nel clonaggio è 500 bp,io purtroppo non sono sicura di aver capio bene..perchè usiamo l'inserto di 500 bp se le bande ottenute sono da 700 e 300 bp?Io ho notato guardando l'elettroforesi che le due bande ottenute si trovano tra la banda del marker di peso molecolare di 500 bp.E'questo il motivo? O c'è qualche altro motivo?Lo scopo di tutto ciò è clonare la regione codificante della relaxina.Quindi dopo il clonaggio io ho eseguito una digestione con l'enzima EcoR-I al fine di escindere l'inserto dal vettore,ma nella digestione c'è una banda in più di 600 bp,(che non doveva esserci)quindi c'è stata probabilmente una contaminazione?Giusto? Poi il mio prof mi ha dato la sequenza codificante con esoni e oligo.Ho un dubbio la sequenza codificante che mi ha dato è quella clonata e come si ricava? E' una cosa diversa se parliamo di sequenziamento? Scusate ma ho molti dubbi e spero che qualcuno riesca a rispondermi.Vi ringrazio in anticipo.



gilthanas
Nuovo Arrivato

0116_da_CIA



100 Messaggi

Inserito il - 26 settembre 2010 : 22:28:50  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di gilthanas Invia a gilthanas un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
aspetta aspetta....calma..ci sono un pò di cose non choare
se fai una RetroTrascrizione la fai per ottenere il cDNA totale da tutti gli mRNA cellulari..c'è un tipo speciale di questa reazione che si chiama one -step in cui nella miscela aggiungi anche dei primer specifici per il tuo gene in questione....questo solo per chiarire i punti...
dopo il gel come è possibile che ottenete 2 bande? la PCR deve essere specifica per il tuo cDNA di interesse. perchè hai estratto entrambe le bande? e poi dopo dice di aver usato un nuovo frammento da 500??????
hai controllato le dimensioni attese del cDNA della relaxina? se vai sul sito ensembl o su OMIM di ncbi troverai tutti gli esoni del gene, la sequenza codificante e conoscendo la sequenza dei primers potrai dedurne le dimensioni attese della PCR.

la digestione con EcoRI
sai con esattezza dove taglia l'enzima? A monte e a valle del tuo cDNA?
escuderei senza dubbio la contaminazione, al massimo sarà un clone non corretto dove 'inserzione del tuo frammento non è avvenuta correttamente...sempre che di un inserto si tratti...

Poi, gli oligo che ti ha dato dopo, probabilmente saranno per il sequenziamento del frammento clonato, ossia il conoscere esattamente i nucleotidi della tua sequenza, per confermare che quello che hai clonato sia giusto, visto che con la PCR potrebbero essere avvenuti degli errori da parte della Taq Polimerasi.

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