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zerhos
Utente Junior
Prov.: Pisa
Città: Pisa
421 Messaggi |
 Inserito il - 01 ottobre 2010 : 20:45:27
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ho dei seri problemi ad accettare il metodo che mi fanno usare in laboratorio per analizzare i dati di real time, probabilmente sono nel torto io, ma non mi sembra del tutto esatto come metodo.
provo a farne una versione semplificata
-metodo relativo
-controllo+ tre casi
-2 repliche per 2 estrazioni differenti alla stessa concentrazione di cDNA di partenza
quindi si ha una situazione di questo tipo:
K+1,1 K+2,1
K+1,2 K+2,2
trattamento(x) 1,1 trattamento(x)2,1
trattamento(x) 1,2 trattamento(x)2,2
trattamento(y) 1,1 trattamento(y)2,1
trattamento(y) 1,2 trattamento(y)2,2
trattamento(z) 1,1 trattamento(z) 2,1
trattamento(z) 1,2 trattamento(z) 2,2
E UGUALE SITUAZIONE PER L HOUSEKEAPING(UN TOTALE DI 24 EPPENDORFINE ESCLUSI I BIANCHI)
per ogni replica il programma già da solo mi da la media
con le medie delle repliche calcolo i vari dCT.
ora per fare il ddCT, scelgo il dCT dEI controlli che presenta una deviazione standard più bassa e lo uso come standard.
se lo chiamiamo ddCTk+1 allora sarà:
dCTk+1-dCTk+1=0
dCTk+1-dCTk+2=n
dCTk+1-dCTtratt(x)1=n
dCTk+1-dCTtratt(x)2=n
dCTk+1-dCTtratt(y)1=n
dCTK+1-dCTtratt(y)2=n
ecc...
ora faccio la media delle rese di amplificazione generalmente attorno ad 1,8 e faccio:
1,8^-ddCT,quindi:
1,8^-0=1
ecc...
quindi che cosa ottengo(valori inventati,tranne il primo ovviamente che è il controllo standardizzato)
controllo espressione= 1--------->estrazione uno
controllo2 espressione= 0,98785---->estrazione due
trattato(x) espressione= 0.4-------->come sopra
trattato(x)2 espressione= 0.35
trattato(y) espressione= 0,245------>come sopra
trattato(y)2 espressione= 0.192352
trattato(z) espressione=0,1001------->come sopra
trattato(z)2 espressione= 0,0982
a questo punto è giusto fare le medie tra i 2 valori?
sgrossando velocemente otterrei:
1;
0,4;
0,2;
0,1
questi valori da me si intendono in questa maniera poi,1 è il valore standardizzato nel controllo,0.4 è il valore reale che il gene ha nel trattamento x, e non 0.4 VOLTE +/- concentrato del controllo a seconda di dove casca di ct del grafico. è giusto,secondo voi?
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"l'unica differenza tra me e un pazzo è che io non sono pazzo!"
Salvador.Dalì
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