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MarcoSS
Nuovo Arrivato
3 Messaggi |
 Inserito il - 04 ottobre 2010 : 15:49:43
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Ciao a tutti,
chi per cortesia mi indica dettagliatamente l'occorrente per allestire un laboratorio di PCR REAL TIME considerando anche il necessario per l'estrazione ?
Grazie per l'aiuto
Marco
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giorgia22
Nuovo Arrivato
15 Messaggi |
Inserito il - 05 ottobre 2010 : 11:20:50
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ciao Marco,
io lavoro con DNA batterico, considero tutto quello che t servirebbe a partire dall'estrazione ma considerando la mia esperienza e i protocolli da me utilizzati,che magari potrebbero cambiare da lab a lab; t faccio un elenco:
-gilson, puntali, eppendorf
-centrifuga
-autoclave (le soluzioni madri, dalle quali si ottengono quelle utilizzate nei vari step dell'estrazione del DNA, vengono autoclavate
-vortex
-piastra riscaldante
-bagnetto termostatato e -20 (il bagnetto termostatato per la fase dell'estrazione nella quale agisce il lisozima, e il -20 per la conservazione dei campioni di dna estratti)
-camera elettroforetica
-kit di purificazione del DNA
-cappa microbiologica e cappa chimica
Spero di esserte stata d'aiuto!
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gilthanas
Nuovo Arrivato
100 Messaggi |
Inserito il - 09 ottobre 2010 : 13:00:10
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beh dipende...
se si tratta di un laboratorio di real time PCR normale non di batteri ma da RNA qualsiasi estratto da cellule, linfociti, tumore etc, etc, la cappa microbiologica ed il bagnetto riscaldato ovviamente non servono più, ma quella chimica sempre!!...
Aggiungerei alcune altre cose fondamentali:
1) la macchina per la Real-time PCR (Corbett, Biorad, Applied le migliori...)
2) un termociclatore per provare le coppie di primer e per generare il cDNA
3) un kit di retrotrascrizione (per ottenere appunto il cDNA)
4) un kit di estrazione dell'RNA (l'RNAeasy della Qiagen è uno dei migliori)
5) nel caso non usi il kit di estrazione puoi estrarlo senza kit e quindi servono molti reagenti, quali solventi organici come beta-mercaptoetanolo (che serve anche x il kit), Trizol, isopropanolo, etanolo 100% (che serve anche per il kit)
6) se hai parecchi soldi a disposizione anche uno spettrofotometro per quantificare l'RNA estratto (meglio comprare un Nanodrop allora...molto più funzionale e veloce dei normali spettrofotometri)
7) le cuvette se opti x spettrofotometro
8) nel caso del kit qualcosa per lisare/distruggere le cellule...in genere si usano delle siringhe sterili con aghi molto sottili e si fa passare la soluzione ripetutamente, oppure un sonicatore, oppure un potter ma non ne vale la pena
9) puntali col filtro
10) un kit per la detectare il segnale nella macchina da real-time, ossia una mastermix, con Sybr-green, Eva-green o adatta all'utilizzo delle sonde TaqMan ma questo dipende da te
11) plasticheria dedicata per le reazioni di PCR e questo dipende dalla macchina in questione
12) una macchina in grado di generare il ghiacchio, necessaria per l'RNA ed i reagenti per la retrotrascrizione e la real-time PCR
beh direi che ci siamo... |
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MarcoSS
Nuovo Arrivato
3 Messaggi |
Inserito il - 20 ottobre 2010 : 10:56:53
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Grazie per le delucidazioni.
Si tratta di utilizzare kit diagnostici veterinari commerciali in Real Time sia per la ricerca di batteri che di virus che di protozoi.
Quindi ricapitolando oltre allo strumento RealTime occorrono:
1)due set di pipette separati , uno per estrazione e uno per la preparazione dei reagenti (mastermix etc) ( che volumi devono avere?)
2)Centrifuga per microtubi ( refrigerata o no? )
3)Vortex
4)L'autoclave è necessaria?
5)Cappa chimica per preparazione reagenti di estrazione (trizol etc)
6)Cappa Biohazard all'interno della quale estrarre RNA ( ma è proprio necessaria? serve per la protezione dell'operatore o per evitare contaminazioni crociate? )
7) Bagnetto termostatato
8) freezer -20 per conservazione dei kit
Giusto ? |
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