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ale88n
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 Inserito il - 08 ottobre 2010 : 20:31:54
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ciao a tutti, da un pò di tempo mi capita che dopo la fase di estrazione del DNA con kit promega minipreps, inizio la fase di digestione enzimatica con Xban e BGL2 della durata di un ora e venti minuti, ecco alla fine di questa fase inizio a caricare il marker in pozzetto (su gel di agarosio al 1%) e il loading in eppendolf bene a fine della corsa potenziometrica le bande di interesse sotto i raggi UV non si vedono, quindi gli enzimi non hanno tagliato il mio plasmide.
cosa può essere successo???
grazie anticipatamente.
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SpemannOrganizer
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Inserito il - 08 ottobre 2010 : 23:43:56
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forse potremmo darti una mano se ci dicessi quanto plasmide digerisci, quanto enzima usi, se hai usato il buffer appropriato per entrambi (se non ce n'è uno compatibile per entrambi devi digerire prima con uno poi con l'altro). Hai corso anche il plasmide nn digerito? Concentrazione e pulizia del DNA sono nella norma?
In bocca al lupo |
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ale88n
Nuovo Arrivato
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Inserito il - 10 ottobre 2010 : 09:37:46
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| allora conc del DNA è di 10 microlitri, il buffer è quello appropriato ovvero D, dei enzimi ne uso 2 microlitri (sono concentrati 10X) per ciascuno ed ho corso anche il plasmide non digerito, dopo la fase di incubazione (digestione), metto 5 microlitri di marker e 2 microlitri di loading in eppendolf |
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SpemannOrganizer
Utente
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Inserito il - 10 ottobre 2010 : 11:29:44
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10 microlitri non è la concentrazione, ma solo il volume. Hai quantificato il DNA allo spettrofotometro, prima di digerirlo? Magari la quantità di DNA che stai digerendo è molto esigua, e quando vai a caricare la digestione (carichi solo 2 ul del volume totale di digestione) forse ne hai talmente poco che nn riesci a vederlo.
Ricorda che è assolutamente importante sapere quanto DNA digerisci e quanto DNA carichi nel pozzetto del gel.
Poi hai detto che usi 2 ul di enzima ciascuno... qual è il volume finale? Ricorda che gli enzimi sono tenuti in glicerolo al 50%, e concentrazioni finali di glicerolo maggiori uguali al 5% inibiscono spesso la reazione di digestione. Ciò vuol dire che il volume totale di enzima (o la somma dei volumi degli enzimi) deve essere MINORE di 1/10 del volume finale.
Tanto per fare un esempio io digerisco in genere per 2h alla T ottimale per l'enzima 5 ug di DNA usando 3ul di enzima (circa 30 unità - ma dipende da quanto è conc. l'enzima che usi) in un volume finale di 60 ul.
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ale88n
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Inserito il - 10 ottobre 2010 : 12:58:04
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| allora domani lo quantifico in spettrofotometria ma penso che il DNA sia poco concentrato forse 2nanogrammi microlitro, speriamo bene!!! |
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SpemannOrganizer
Utente
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Inserito il - 10 ottobre 2010 : 14:17:35
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se fosse davvero 2 nanogrammi/ul col caolo che lo vedi su gel. Quantificalo per bene, tieni conto che per vedere senza ombra di dubbio una digestione è consigliabile caricarne tra i 100-200 nanogrammi (ma questo dipende anche dal rapporto che esiste tra le dimensioni dei vari frammenti ottenuti). Ti consiglio di fare così:lo quantifichi, ne digerisci un microgrammo, in un volume totale di reazione non troppo grande (30 ul dovrebbero andare bene). Fai attenzione alla quantità di enzima che usi: per un microgrammo di DNA 1 ul di uno e 1ul dell'altro dovrebbero fare (guarda anche le unità per microlitro: in genere per ottenere digestioni complete si usa un eccesso di enzima di 3-5 volte superiore rispetto al DNA.).
Poi quando hai finito la digestione, spinni (per raccogliere tutto il DNA in fondo alla eppendoRf), ne peschi 5 ul (che dovrebbero corrisponderti a circa 170 ng se hai digerito 1 ug DNA in 30 ul totali) e aggiungi 1 ul di loading buffer e carichi sul pozzetto del gel.
Che dimensioni hanno i frammenti ottenuti? Questo è importante saperlo, al fine di caricare la quantità giusta di DNA sul gel per vedere in maniera inconfondibile tutti i frammenti ottenuti dalla digestione.
P.S.: dubito comunque che tu abbia ottenuto così poco plasmide dalla mini |
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biologomolecolare84
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Inserito il - 15 aprile 2011 : 23:29:26
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Ciao a tutti,
ho un problema diverso che riguarda le digestioni.
Per mancanza di fondi, sono costretto a estrarre DNA plasmidico mediante estrazione Phe/Clo. Quando controllo le miniprep vedo delle belle bande (classiche da miniprep con le 3 forme plasmidiche) e quando vado a leggere al nanodrop vedo che più o meno le concentrazioni oscillano intorno a 5 µg/µl.
Ho provato a digerire 20 #947; (4 µl di miniprep)per 2h a 37°C in un volume finale di 50 µl in questo modo:
costrutto: 4 µl
Buffer 10X: 10 µl(2X)
XhoI: 1,5 µl
BamHI: 3 µl
e quando ho caricato interamente la digestione vedo delle bande molto sottili...perchè? se ho digerito 20 #947;, e carico tutto, mi aspetto di vedere 20 #947;!!!
La concentrazione dell'inserto recuperato da gel mediante kit è circa 6 ng/µl.
Possibile che da 20 µg di costrutto io riesca a recuperare solo 6 ng/µl di inserto?
Mi è venuto il dubbio che il nanodrop possa leggere qualcosa che non sia DNA plasmidico (forse il genomico)?
Utilizzando un kit per miniprep potrei risolvere il problema?
Grazie per la cortese risposta.
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SpemannOrganizer
Utente
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Inserito il - 16 aprile 2011 : 00:46:41
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| forse qualcosa falsa la tua lettura al nanodrop.quanto è pulito il tuo dna? Poi hai qualche marker a concentrazione nota con cui fare riferimento sul gel? |
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biologomolecolare84
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Inserito il - 16 aprile 2011 : 21:48:41
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il dna direi che è abbastanza pulito...il nanodrop mi da anche i rapporti di assorbanza 260/280 e 260/230...sono entrambi intorno a 2 (ciò mi indica la purezza della miniprep). Il marker che uso è il seguente: O'GeneRuler DNA Ladder Mix...mi sapresti spiegare come si fa a risalire alla concentrazione del campione?
Grazie mille. |
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SpemannOrganizer
Utente
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Inserito il - 16 aprile 2011 : 22:35:18
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| sul datasheet dovresti trovare le informazioni necessarie: a ogni banda corrisponde una certa quantità in ng.In questo modo puoi confrontare il tuo campione con le bande del ladder e determinarne la conc. (in genere si confronta con la banda di dimensione simile a quella del tuo campione). non so se tutti i ladder disponibili in commercio hanno questa caratteristica, dovresti guardare il datasheet del tuo. |
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biologomolecolare84
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Inserito il - 17 aprile 2011 : 22:35:15
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si...in realtà non capisco bene, perchè mi ritrovo sull'immagine le varie bande a cui corrispondono le varie lunghezze in bp, poi c'è una colonna che mi dice ng/0,5 µg e poi un'altra con %!
E' possibile che quelli siano i ng di dna per 0,5 µg di marker caricato? il marker ha la concentrazione di 0,1 µg/µl...quindi per confrontarlo dovrei caricare 5 µl (così ne ho 0,5 µg nel pozzetto) e poi fare il confronto? |
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SpemannOrganizer
Utente
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Inserito il - 18 aprile 2011 : 13:08:49
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| teoricamente il tuo ragionamento calza, ma non conosco il tuo ladder (io uso lo smart ladder di genetech) e non ho proprio tempo per guardartici... sorry |
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biologomolecolare84
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Inserito il - 28 aprile 2011 : 20:18:46
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| Grazie comunque...il ragionamento era giusto!:-) |
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digestione con Xban e BGL2
Didattica
