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Pearly
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9 Messaggi

Inserito il - 23 ottobre 2010 : 17:30:43  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Pearly Invia a Pearly un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ciao a tutti,
vorrei sapere perchè devo utilizzare i vettori di clonaggio e la successiva trasformazione in cellule batteriche per ottenere tante molecole del frammento di DNA che mi interessa (da utilizzare per una transfezione).
Qual'è il motivo per cui non si usa il prodotto di PCR? Xkè i geni sono troppo lunghi??

Grazie!

GFPina
Moderatore

GFPina

Città: Milano


8380 Messaggi

Inserito il - 23 ottobre 2010 : 18:02:47  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di GFPina  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di GFPina Invia a GFPina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
In realtà quello che ottieni è DNA plasmidico, quindi il vettore con il tuo frammaneto, non solo il frammento!
Il vettore contiene altre sequenze necessarie oltre al gene che hai amplificato per PCR, ad es. le sequenze per la trascrizione e la tradudione del gene, queste sequenze sono riconosciute dalla cellula ospite che provvede quindi alla trascrizione e traduzione del tuo gene, se tu prendessi il frammento di PCR così com'è e lo mettessi nelle cellule queste non saprebbero cosa farsene.

Detto tutto in parole molto povere, ma il senso è questo!
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Pearly
Nuovo Arrivato



9 Messaggi

Inserito il - 23 ottobre 2010 : 18:49:58  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Pearly Invia a Pearly un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Grazie mille!
Il dubbio mi è sorto studiando un esempio di trascrizione in vitro che mi ha fatto il prf di biologia molecolare.
In questo esempio inserisce degli oligont UTR in 5' e 3' attraverso una ligazione ai lati del cDNA codificante la mia proteina e poi lo inserisce in un vettore di clonaggio.
Poi lo linearizza (e dall'immagine sembra excidere la sequenza relativa al vettore di clonaggio) e aggiunge una coda polyA con una PCR.
E' quest'ultima parte che non mi è chiara, non sarebbe meglio aggiungere all'UTR il poly(A)prima di inserirlo nel vettore di clonaggio??
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SpemannOrganizer
Utente

Spemann

Città: Los Angeles


955 Messaggi

Inserito il - 23 ottobre 2010 : 19:16:49  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di SpemannOrganizer Invia a SpemannOrganizer un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
In vivo la coda di polyA viene aggiunta in seguito al taglio dell mRNA, cioé dopo che l'mRNA è stato tagliato al suo 3' da una particolare endonucleasi. il segnale polyA (AATAAA) fornisce l'informazione per il taglio, e la sua corrispettiva parte nell RNA (AAUAAA) promuove la formazione della coda di A da parte di proteine come la polyA adenilasi. La RNA pol II tra l'altro continua a trascrivere anche dopo il taglio dell'mRNA, e la terminazione della trascrizione avviene anche centinaia (se nn migliaia) di basi dopo il segnale di cleavage. Tutto questo avviene in vivo, dove hai un sacco di fattori diversi che provvedono al corretto processamento dell'mRNA. In vitro ovviamente la situazione è semplificata, non hai fattori che tagliano l'mRNA e promuovono la terminazione della trascrizione. Quindi lo si fa fisicamente, tagliando il plasmide poco dopo il segnale di "aggiunta polyA"; questo promuove terminazione trascrizione e "processamento" RNA.

Chiaro?

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Pearly
Nuovo Arrivato



9 Messaggi

Inserito il - 24 ottobre 2010 : 11:26:54  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Pearly Invia a Pearly un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ok ora ho tutto + chiaro! grazie!!!
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