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Nirvangirl
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 Inserito il - 27 ottobre 2010 : 13:30:38
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Salve,
sto facendo diverse ricerche per capire la replicazione del vettore M13 ma non riesco a capire come funziona.
Ho capito che ha un singolo filmento di Dna e che quando viene inserito in E.coli (tramite la dna polimerasi di E.coli)viene generato un filamento complementare, detto - strand,che forma insieme al precendente un doppio filamento chiamato RF (forma di replicazione)
Dopo aver tagliato RF con gli enzimi di restrizione si inserisce il Dna esogeno.
Questo Dna ricombinante viene utilizzato per trasformare le cellule ospiti dando origine a una progenie fagica che possiede Dna ricombinante a singolo filamento.
Quest'ultimo passaggio non mi è chiaro(sperando che i precedenti li abbia capiti ) ,soprattutto il modo in cui si passa da doppio filamento a singolo filamento.
E poi per "trasformare le cellule" cosa intende?
Grazie mille
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_pietro_
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Nirvangirl
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Inserito il - 27 ottobre 2010 : 15:45:32
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| Sisi già visto ma non mi ha chiarito purtroppo :( |
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_pietro_
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Inserito il - 27 ottobre 2010 : 16:02:10
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Proviamo cosi':
http://en.wikipedia.org/wiki/M13_phage
Se non ho capito male, Il filamento positivo del RF DNA viene "lavorato" dalla proteina pII, che prima lo isola, poi lo circolarizza.
Oddio, spero di aver capito bene, non e' il mio campo  |
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_pietro_
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Inserito il - 27 ottobre 2010 : 16:05:26
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Anzi.. direi che la versione italiana rende anche meglio... copio e incollo:
Il Dna del fago che entra nella cellula è a singolo filamento e viene chiamato " + strand". Appena penetrato, l'RNA polimerasi della cellula ospite sintetizza un primer all'origine di replicazione. La DNA polimerasi III dell'ospite inizia a sintetizzare il filamento complementare che viene definito "- strand". Quando Pol III incontra il primer dissocia dal DNA. La DNA Pol I con attività 5' esonucleasica rimuove il primer e riempe il "gap". Infine la Ligasi salda i due tratti di DNA. La sintesi del filamento - dà origine ad un DNA a doppio filamento chiamato "Replicative form". I due filamenti - e + della RF sono poi replicati separatamente e con due meccanismi differenti. Il prodotto del gene 2 è una endonucleasi che produce un nick sul filamento + della RF e rimane attaccata al fosfato in 5' lasciando l'estremità 3' libera. La proteina Rep dell'ospite è una elicasi che aiuta a svolgere il DNA all'altezza del nick. La DNA Pol III dell'ospite utilizza l'estremità 3' libera come primer per la sintesi di un nuovo filamento + mentre il vecchio viene rimosso. Una volta completata la replicazione si ottengono due molecole di DNA: una circolare a doppio filamento e una a singolo filamento dove Gp2 salda le stremità 5' e 3' con una reazione di transesterificazione e ricrea un filamento circolare +. Tale processo continua fino a quando comincia ad accumularsi Gp5. Questa proteina si lega al DNA single-strand + e impedisce che venga ulteriormente replicato. |
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Nirvangirl
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Inserito il - 27 ottobre 2010 : 16:20:29
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Ok dopo aver avuto queste due molecole di dna (1 a doppio filamento e 1 a singolo filamento) cosa succede?
Cioè quella a doppio filamento si può replicare un'altra volta mentre quello a singolo viene estruso con le proteine che formano un capside? |
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Replicazione vettore M13
Didattica
