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etram
Nuovo Arrivato
Prov.: Lucca
2 Messaggi |
 Inserito il - 19 settembre 2006 : 13:35:51
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Salve a tutti, sono un nuovo iscritto al forum anche se ogni tanto vi sono venuto a trovare come ospite.
Come capirete dal topic ho un problema con l'estrazione da tessuto (di topo) di RNA totale utilizzando il Trizol Reagent fornito da Invitrogen.
Il fatto è che ottengo delle rese a termine dell'estrazione 10 volte più basse di quelle attese. Ovvero Invotrogen mi dice che dal fegato di topo dovrei ottenere 5-6ug di RNA per ogni milligrammo di tessuto. Io omogenizzo tra 50 e 60 mg di fegato di topo, estraggo lo RNA secondo il protocollo suggerito risospendo in 50ul di acqua DEPC e ottengo concentrazioni di RNA di circa 0,02ug/ul.
Al contrario con la milza del topo, per 30mg di tessuto iniziale (invitrogen consiglia un minimo di 50mg, ma io me ne sono fregato) estratto e risospeso in 50ul di acqua DEPC, ho una concentrazione di 0,96ug/ul (che non è altissima, ma è già molto più vicina a quella pubblicizzata da Invitrogen).
Se qualcuno ha esperienza o ha riscontrato problemi simili, mi può suggerire un motivo? Devo tenermi sotto i 50mg utilizzando però la stessa quantità di reagente che userei per più di 50mg? Invitrogen pubblicizza una resa che è molto superiore alla resa reale del prodotto/processo? C'è un qualcosa che non va nel loro protocollo?
A quest'ultimo proposito ho visto che nella sezione protocolli (i miei complimenti per aver avuto l'idea ed averla messa su!) c'è l'estrazione di RNA con Trizol. Ho potuto vedere che tutte le quantità di reagente suggerite sono dimezzate e, più che altro, che al punto dell'aggunta dell'isopropanolo si suggerisce di tenerlo in ghiaccio per 10min oippure nel -20 ON, mentre il protocollo di invitrogen dice di tenerlo a RT per 10minuti. Sta qui il trucco?
Grazie infinite in anticipo per l'aiuto e per la pazienza. Colgo l'occasione poi per farvi i complimenti per tutto il sito, per il forum e per la pazienza e l'impegno che ci mettete!
Ciao
Etram (Pisa)
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Privilegia ne irroganto.
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Patrizio
Moderatore
Città: Barcellona
1912 Messaggi |
Inserito il - 19 settembre 2006 : 20:24:22
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Non vorrei difendere l'INVITROGEN perchè sicuramente non ne ha bisogno, ma ho usato lo stesso prodotto e ti posso garantire che è ottimo; quante volte hai fatto l'estrazione? non potrebbe essere solo un caso dovuto magari a qualche errore? Lavorare con L'RNA non è mai facile ma con l'esperienza tutto ti sembrerà più facile. Prova ad estrarlo ancora usando vetreria trattata con prodotti che inattivano l'RNAsi (in tal senso L'AMBION è leader nel campo)e plasticheria monouso RNAsifree, e vedrai che otterrai dei buoni risultati.
P.S. dopo l'aggiunta dell'isopropanolo non ho ottenuto grosse differenze tra i 10 minuti a RT o a -20, ma ti consiglio di lasciarlo anche 20 minuti a -20 o a -80 per 10 minuti.
In bocca al lupo
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Anyra
Utente Junior
Prov.: Pesaro-Urbino
Città: Saltara
212 Messaggi |
Inserito il - 20 settembre 2006 : 09:23:04
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Sinceramente anche io ho avuto alcuni problemi con il trizol, ma partivo da tessuti estremamente tosti (in realtà semplici foglie, ma la parete cellulare era ardua da rompere).
Successivamente ho provato il kit di estrazione della Qiagen (non vorrei fare pubbblicità....) e mi sono trovata molto bene.
Se non sei vincolato al trizol da procedure registrate io fossi in te un tentativo lo farei. Il kit minimo è da 20 reazioni se non sbaglio, ed è molto veloce.
In bocca al lupo
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Il mio Cavaliere
http://s4.battleknight.it/index.php?loc=hire&ref=OTA3NTAw |
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etram
Nuovo Arrivato
Prov.: Lucca
2 Messaggi |
Inserito il - 20 settembre 2006 : 13:53:10
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Prima di tutto grazie per la risposta!
Per Patrizio: non era la prima estrazione e prima di trovare il coraggio di postare sul forum ho fatto diversi tentativi. La plastica che uso per l'estrazione è tutta RNAasi free, anche se ciò, a detta di Invitrogen, non sarebbe nemmeno necessario perché in presenza di Trizol lo RNA è protetto dalle aggressioni enzimatiche. Non uso vetreria proprio per essere sicuro della sterilità degli oggetti. Il cloroformio e l'isopropanolo sono prodotti specifici per la biologia molecolare. Non fraccio l'estrazione con omogenizzatori, sempre per evitare la contaminazione e di dover sterilizzare tutto mille volte, ma con siringhe monouso sterili con aghi a diametro decrescente (l'idea non è mia ma di un lavoro trovato su PubMed). Le forbici che uso per tagliare il pezzo di organo da omogenizzare e per dare la prima sgrossata sono sterilizzate a secco e dopo l'uso trattate con detergenti anionici forti e sterilizzate a secco di nuovo.
Proverò adesso altri lotti di tessuto che ho nel -80 e poi dopo il passaggio in isopropanolo a mettere l'omogenato nel -80 per 10 minuti anziché a RT. Ti faccio sapere.
Per Anyra: purtroppo sono vincolato a finire il Trizol prima di poter comprare altri kit! Durante le mie peregrinazioni su internet per trovare una soluzione al problema ne ho visti migliaia di kit di estrazione e tutti mi facevano gola! Ma non posso far comperare un altro prodotto al momento. Bisogna dire però che prima di comprare il Trizol, ci facemmo consigliare da altri che lo usavano e dalle pubblicazioni e tutti erano daccordo con Patrizio nel dire che era un prodotto molto buono!
Forse porto sfiga? :D
Grazie per l'interessamento! |
Privilegia ne irroganto.
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Maledetto TRIZOL
Didattica
