Fluo-4 e ionomicina!

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Ilarynmf90
Nuovo Arrivato

37 Messaggi

Inserito il - 10 novembre 2010 : 21:24:42

ciao, sapreste spiegarmi la tecnica per visualizzare la concentrazione di calcio intracellulare con uso di fluo-4? in particolare vorrei sapere nel caso del trattamento con ionomicina (che permette l'ingresso di calcio extrac.)come si fa a determinare la concentrazione di fluo 4 da inserire in modo che tutto il calcio che si trova nella cellula sia legato?
grazie

chick80
Moderatore

Città: Edinburgh

11491 Messaggi

Inserito il - 11 novembre 2010 : 08:49:44

Citazione:
come si fa a determinare la concentrazione di fluo 4 da inserire in modo che tutto il calcio che si trova nella cellula sia legato?

Semplicemente non lo fai! Non vuoi assolutamente inserire tutto quel fluo-4 (ovviamente ciò vale per qualsiasi altro indicatore), l'importante per calibrare l'esperimento (immagino sia per questo che usi la ionomicina) è di sapere la fluorescenza -o la ratio nel caso di indicatori ratiometrici- a concentrazione saturante e concentrazione nulla di Ca2+.

La concentrazione di indicatore deve essere la stessa che durante gli esperimenti veri e propri, altrimenti non puoi comparare i risultati. In generale diminuire la concentrazione di indicatore è positivo per la salute delle cellule (ma ovviamente non puoi diminuire troppo altrimenti non vedi più la fluorescenza!)

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Ilarynmf90
Nuovo Arrivato

37 Messaggi

Inserito il - 11 novembre 2010 : 18:50:15

ma se permetto l'ingresso di Ca2+ dall'ambiente extracellulare non rischio di avere Ca2+ in eccesso che non si lega a fluo-4 (perchè ormai saturato)? in questo caso non riuscirei a risalire all'esatta concentrazione di Ca2+... correggimi se sbaglio e grazie per la risposta!

chick80
Moderatore

Città: Edinburgh

11491 Messaggi

Inserito il - 11 novembre 2010 : 19:13:25

Beh, ci saranno sempre delle molecole di calcio non legate all'indicatore. Se fossero tutte legate all'indicatore la cellula non avrebbe più calcio disponibile per funzionare!

La fluorescenza dell'indicatore è PROPORZIONALE alla concentrazione di Ca2+.

E' poi chiaro che il range di calcio che puoi analizzare con un certo indicatore dipende dalla sua Kd per il calcio. Se hai una Kd bassa puoi analizzare [Ca2+] più elevate (ma perderai "risoluzione" alle basse concentrazioni) e viceversa.

Il Fluo-4 ha una Kd di ~350nM, e può essere senza problemi utilizzato nel range 100nM-1uM

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