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federica81
Nuovo Arrivato
Prov.: Modena
Città: modena
9 Messaggi |
 Inserito il - 20 settembre 2006 : 15:05:03
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ciao ragazzi come faccio a dimostrare che campioni di RNA estratto da tessuti non sono contaminati da DNA genomico? Io pensavo a una normale PCR. Ma se è così quanto RNA devo caricare per essere nelle condizioni ideali?
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 20 settembre 2006 : 22:16:01
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La cosa più facile è fare una PCR con dei primer che amplifichino parte di un introne (e parte di un esone).
In questo modo vedi se hai DNA contaminante.
Se l'introne non è molto lungo puoi anche fare i primers sui due esoni fiancheggianti così avrai 1 sola banda in presenza di mRNA e 2 bande in presenza di mRNA + DNA genomico (che darà la banda più lunga).
Per la quantità di RNA dipende dal gene, dai primers, da quanto contaminante hai etc etc
Conta che noi questa cosa la facciamo su single cell PCR, quindi con una quantità infima di mRNA. |
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biotech
Utente Junior
Prov.: Padova
Città: Padova
170 Messaggi |
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cin
Utente Junior
Prov.: Padova
Città: Padova
558 Messaggi |
Inserito il - 27 settembre 2006 : 16:57:35
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Non penso che tu riesca a vedere nessuna contaminazione tramite spettrofotometro, la cosa più semplice se non vuoi costruirti i primers come ha detto cick, è quella, che puoi fare sempre e per qualsiasi campione. Quando fai l'RT dividi il campione a metà : uno lo tratti normalmente mettendo tutti i tamponi che vanno messi+ l'enzima (RT+), per l'altra metà invece fai tutto uguale,ma al posto dell'enzima ,la mulv,metti H2O (RT-). Dopo l'RT andrai a fare la PCR del 18S o di un qualsiasi housekeeping e gli RT- dovranno essere negativi.
Spero di essermi spiegata bene..... |
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cin
Utente Junior
Prov.: Padova
Città: Padova
558 Messaggi |
Inserito il - 27 settembre 2006 : 17:02:41
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| Ah, dimenticavo, un altro metodo è quelli di correre i campioni su apparecchi come il Bioanalyzer dell' Agilent, dove si "dovrebbe" vedere la contaminazione da DNA. |
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federica81
Nuovo Arrivato
Prov.: Modena
Città: modena
9 Messaggi |
Inserito il - 28 settembre 2006 : 13:13:21
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| ma se faccio una PCR direttamente sull'RNA non va bene.Tanto la DNA Polimerasi è DNA dipendente quindi se non c'è DNA genomico non si amplifica niente, mentre se c'è troverò una banda corrispondente al frammento compreso tra i due primer che ho inserito. |
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Discussione |
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contaminazione da DNA genomico
Didattica
