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biotech89
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 Inserito il - 20 novembre 2010 : 09:53:21
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ciao a tutti!
mi sto preparando per un esame di biochimica 1 e non riesco proprio a capire come funziona l'ordine di eluizione nella cromatografia a scambio ionico.
negli esercizi in genere mi viene detto il pH della soluzione, il tipo di resina (a scambio cationico o anionico), e poi mi chiedono in che ordine eluiranno certi amminoacidi.
io ho guardato sui libri, ma non sono molto chiari (probabilmente sono io che sono tonta) perchè non spiegano bene come e quali calcoli devo fare...per esempio mi chiedevo se il pH corrisponde sempre al pka in questi esercici, oppure se devo ricavare dal pH il pKa, e se si, come??
help!!
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0barra1
Utente Senior
Città: Paris, VIIème arrondissement
3847 Messaggi |
Inserito il - 20 novembre 2010 : 14:30:17
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| In breve, in base al pH della fase mobile i tuoi aminoacidi avranno una propria carica, determinata dal loro pI, cosa che credo tu già sappia. Ora è facile determinare l'ordine di eluizione: con uno scambiatore anionico avrai che gli aa carichi negativamente tenderanno ad interagire con la fase solida, venendo ritenuti nella colonna, mentre aa carichi negativamente non potranno allacciare interazioni elettrostatiche con la colonna, per cui eluiranno molto più rapidamente. Per esempio, a pH 7 ti aspetterai che l'Arginina presenti carica netta positiva (dovuta alla ionizzazione del suo gruppo guanidinico), mentre l'aspartato sarà carico negativamente. Quale dei due, in una resina a scambio anionico, avrà tempo di ritenzione maggiore? |
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biotech89
Nuovo Arrivato
97 Messaggi |
Inserito il - 20 novembre 2010 : 17:49:35
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in quel caso R sarà eluita per ultima, giusto? però la carica di R non l'ho ricavata guardando il pI (che non so come si fa!), ma ragionando su i 3 vari pKa dell'amminoacido.
quello che non capisco è come devo considerare il pI rispetto al pH dato della soluzione, per capire qual è la carica di un amminoacido?? |
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0barra1
Utente Senior
Città: Paris, VIIème arrondissement
3847 Messaggi |
Inserito il - 20 novembre 2010 : 18:23:44
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Purtroppo scrivendo il messaggio soprastante ho commesso un errore di battitura, per cui la frase risulta poco sensata. Ora ho corretto:
Citazione:
Messaggio inserito da 0barra1
con uno scambiatore anionico avrai che gli aa carichi negativamente tenderanno ad interagire con la fase solida, venendo ritenuti nella colonna, mentre aa carichi negativamente positivamente non potranno allacciare interazioni elettrostatiche con la colonna, per cui eluiranno molto più rapidamente.
Ora, tornando a noi. Uno scambiatore anionico significa che scambia, e dunque trattiene, anioni. La resina deve perciò possedere carica positiva. Trattenendoli, ne rallenta l'eluizione. Nel caso dell'esempio, perciò, il glutammato interagirà con la colonna ed eluirà più lentamente dell'arginina che invece, per repulsione elettrostatica sarà costretta a rimanere nella fase mobile.
In realtà ragionando sui diversi pKa dell'aminoacido ti stai avvicinando al concetto di pI. Nel caso di singoli aa, il pI è la media aritmetica del pKa del gruppo amminico (diciamo circa 9) e del gruppo carbossilico (circa 2). Il pI della Gly sarà perciò (9+2)/2 = 5.5 . La cosa si complica per gli aminoacidi che possiedono altri gruppi ionizzabili oltre al COO- e NH3+ legati al carbonio alfa. In questo caso dovrai calcolare il pI come media dei pKa più simili tra loro. Nel caso della lisina, che possiede due gruppi amminici, uno in alfa e l'altro in epsilon, farai la media del pKa di questi due, tralasciando nel calcolo il pKa del gruppo carbossilico legato in alfa.
Ora, il pI è un concetto importante in cromatografia a scambio ionico perché come sai il pI di una molecola è il valore di pH a cui quella molecola presenta carica NETTA pari a zero. Variando il pH puoi perciò alterare la carica netta della tua molecola. Come working rule puoi pensare che quando pH(soluzione) > pI(tua molecola) la molecola sarà carica negativamente e viceversa per pH < pI. Ovviamente è meglio che tu ci ragioni un po' su però, inoltre ricorrendo alla funzione cerca del forum potrai trovare molte spiegazioni in materia redatte da utenti del forum molto preparati e competenti.
Il punto è che variando adeguatamente il pH della fase mobile puoi aumentare la risoluzione della tua cromatografia a scambio ionico. Immagina per esempio di dover separare l'aa R (poniamo pI=10.76) da un altro ipotetico aa di pI=8.5 con una cromatografia a scambio cationico (ciò che trattiene molecole cariche positivamente). Ora, non avrebbe senso usare una fase mobile a pH 7 fisso (si parla in questo caso di cromatografia isocratica), in quanto essendo i pI di entrambi gli aa maggiori di 7, entrambi gli aa sarebbero carichi positivamente (pH<pI) e si legherebbero in modo analogo alla colonna. I tempi di eluizioni sarebbero perciò talmente simili che i due analiti sarebbero indistinguibili e impossibili da separare.
Conducendo una cromatografia a pH 8.5 (non so quanto un pH così basico faccia bene ad una colonna), ti troveresti a fronteggiare una situazione molto più favorele: in tali condizioni R rimane sempre carico positivamente, e capace di interagire con la colonna, mentre l'altro la carica netta dell'altra molecola è pari a ZERO (perché per essa si ha pI=pH) e perciò incapace di lagare la fase stazionaria. La diretta conseguenza è che quest'ultima, con la tua nuova cromatografia isocratica a pH=8.5 eluisce più rapidamente di R e i due analiti posso perciò ora essere distinti e separati.
Al di là di questo esempio, va osservato che nella realizzazione di questi esperimenti si considera il pI dell'analita in quanto solitamente esso è una molecola, molto spesso proteina, di un grado di complessità molto superiore ai singoli aminoacidi, dotata di decine, se non centinaia di gruppi ionizzabili. In questo caso, come è facile immaginare, risulterebbe pressoché impossibile soffermarsi a riflettere sui pKa dei singoli gruppi. |
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biotech89
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Inserito il - 20 novembre 2010 : 18:36:52
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Citazione:
Messaggio inserito da 0barra1
Ora, il pI è un concetto importante in cromatografia a scambio ionico perché come sai il pI di una molecola è il valore di pH a cui quella molecola presenta carica NETTA pari a zero.
cos'è il pI lo so, ma non capisco qual è il senso nell'utilizzarlo per la cromatografia a scambio ionico 
Citazione:
Messaggio inserito da 0barra1
Come working rule puoi pensare che quando pH(soluzione) > pI(tua molecola) la molecola sarà carica negativamente e viceversa per pH < pI. Ovviamente è meglio che tu ci ragioni un po' su però.
no please !!!
ho provato ma non riesco a capire!!
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0barra1
Utente Senior
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Inserito il - 20 novembre 2010 : 18:43:36
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Ho leggermente modificato il messaggio, prova a rileggerlo con calma.
E a rifletterci sopra.
Riassumendo, il presupposto di una cromatografia a scambio ionico è che tu dovrai avere cura che le tue molecole di interesse siano in grado di interagire con la fase stazionaria. Tra le due, perciò dovranno sussistere delle interazioni elettrostatiche.
Scegliendo il pH della fase stazionaria in modo adeguato, potrai perciò fare si che la proteina, poniamo il caso di trovarci nel mondo della proteomica, di tuo interesse abbia una carica tale da potersi legare alla fase stazionaria.
Ma come scelgo il pH? In base al pI del tuo analita.
Questo perché la carica di una proteina, non è una caratteristica assoluta della molecola stessa, bensì dipende dall'ambiente circostante, nello specifico dal suo pH. A pH diversi, una proteina potrà possedere o meno carica netta diversa, a seconda della relazione che sussiste tra esso e il suo pI, proprietà intrinseca della molecola. |
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biotech89
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Inserito il - 20 novembre 2010 : 18:55:57
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ok, grazie al tuo discorso comincio a capire il discorso del pI
mi chiedevo però come funziona per gli aa neutri (A, N, C,....).
per esempio in questo esercizio a me risulterebbe che l'A, ha carica positiva! invece la risposta esatta dice diversamente....
Quale dei seguenti amminoacidi ha carica netta +2 a pH basso e quale ha carica netta -2 a pH elevato? Acido aspartico, alanina, arginina, acido glutammico, leucina, lisina.
A pH basso arginina e lisina hanno carica netta +2 perché hanno catene laterali basiche protonate
A pH elevato acido aspartico e glutammico hanno carica netta -2 per le loro catene laterali acide dissociate
Le catene laterali degli altri amminoacidi non vengono titolate
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0barra1
Utente Senior
Città: Paris, VIIème arrondissement
3847 Messaggi |
Inserito il - 20 novembre 2010 : 19:07:40
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Citazione:
Messaggio inserito da biotech89
ok, grazie al tuo discorso comincio a capire il discorso del pI
Quale dei seguenti amminoacidi ha carica netta +2 a pH basso e quale ha carica netta -2 a pH elevato? Acido aspartico, alanina, arginina, acido glutammico, leucina, lisina.
A pH basso arginina e lisina hanno carica netta +2 perché hanno catene laterali basiche protonate
A pH elevato acido aspartico e glutammico hanno carica netta -2 per le loro catene laterali acide dissociate
Nota, nel caso di Lys e Arg per poter dire che la carica netta è +2 il pH deve essere almeno di 2, così che il carbossile sia protonato e porti carica zero.
Discorso uguale per Asp e Glu, il pH deve essere perlomeno attorno a 9, di modo che il gruppo amminico sia scarico.
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0barra1
Utente Senior
Città: Paris, VIIème arrondissement
3847 Messaggi |
Inserito il - 20 novembre 2010 : 19:08:58
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Citazione:
Messaggio inserito da biotech89
mi chiedevo però come funziona per gli aa neutri (A, N, C,....).
per esempio in questo esercizio a me risulterebbe che l'A, ha carica positiva! invece la risposta esatta dice diversamente....
Potresti postare l'esercizio o riassumerlo? |
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biotech89
Nuovo Arrivato
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Inserito il - 20 novembre 2010 : 19:12:46
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eccolo
Domanda: Quale dei seguenti amminoacidi ha carica netta +2 a pH basso e quale ha carica netta -2 a pH elevato? Acido aspartico, alanina, arginina, acido glutammico, leucina, lisina.
Risposta corretta: A pH basso arginina e lisina hanno carica netta +2 perché hanno catene laterali basiche protonate
A pH elevato acido aspartico e glutammico hanno carica netta -2 per le loro catene laterali acide dissociate
Le catene laterali degli altri amminoacidi non vengono titolate (cosa vuol dire??)
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0barra1
Utente Senior
Città: Paris, VIIème arrondissement
3847 Messaggi |
Inserito il - 20 novembre 2010 : 19:23:17
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Citazione:
Messaggio inserito da biotech89
eccolo
Domanda: Quale dei seguenti amminoacidi ha carica netta +2 a pH basso e quale ha carica netta -2 a pH elevato? Acido aspartico, alanina, arginina, acido glutammico, leucina, lisina.
Risposta corretta: A pH basso arginina e lisina hanno carica netta +2 perché hanno catene laterali basiche protonate
A pH elevato acido aspartico e glutammico hanno carica netta -2 per le loro catene laterali acide dissociate
Le catene laterali degli altri amminoacidi non vengono titolate (cosa vuol dire??)
Immagino si riferisca alla titolazione, indicando cioè che non si assiste a cambiamenti della carica della catena latera di Ala e Leu per aggiunta di acidi o basi a loro soluzioni. Cosa che peraltro è del tutto sensata, trattandosi di catene laterali idrofobiche. |
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biotech89
Nuovo Arrivato
97 Messaggi |
Inserito il - 20 novembre 2010 : 19:36:56
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ah ok!
ho capito
per adesso mi fermo qui.
sei stato davvero gentilissimo (sei un uomo giusto?? ). |
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0barra1
Utente Senior
Città: Paris, VIIème arrondissement
3847 Messaggi |
Inserito il - 20 novembre 2010 : 19:38:41
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Si, sono il ragazzo in foto che sta azzannando la fidanzata
Piacere di averti aiutato  |
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