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Petemme
Nuovo Arrivato




93 Messaggi

Inserito il - 21 settembre 2006 : 19:19:19  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Petemme Invia a Petemme un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Salve a tutti! :)
Volevo delle info perkè tra poco ho un esame :)
Che differenza c'è nell'usare un controllo interno esogeno od endogeno in RT-PCR relativa? Quali parametri vado a testare? E quali sono i vantaggi e gli svantaggi dei due tipi di controllo?
Un'ultima cosa: qual'è il ruolo del calibratore e come viene fatto il raffronto col campione?
Ancora un aiuto :)
Come si allestisce una RT-PCR assoluta e come si vedono i risultati?

Grazie 1000!!


Grazie!!

Petemme
Nuovo Arrivato




93 Messaggi

Inserito il - 28 settembre 2006 : 12:57:08  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Petemme Invia a Petemme un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
L'esame l'ho fatto ed è andato bene :)
L'assoluta alla fine l'ho capita, più ke altro era la curva standard ke mi metteva in difficoltà perkè l'avevano spiegato veramente di m....! Però alla fine ho raccolto un po' di materiale qua e là :)
Anke la relativa è ok però non ho trovato niente sulla differenza ke c'è tra un controllo esogeno e uno endogeno ai termini dell'analisi.. nessuno me l'ha saputo spiegare.. anke il calibratore a dire il vero non è ke mi sia kiarissimo.. mi sembra di aver capito ke serva per la normalizzazione dei risultati :)
La mia curiosità è ancora tanta e anke se non mi serve più per l'esame vorrei capirlo lo stesso. E' difficile immaginare le cose quando non l'hai mai fatte. Abbastanza ridicolo direi fare così poca pratica (ma non voglio andare ot).
Continuo a rompervi :)

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cin
Utente Junior

ptero

Prov.: Padova
Città: Padova


558 Messaggi

Inserito il - 28 settembre 2006 : 14:01:46  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di cin Invia a cin un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Io sinceramente non sapevo cosa dirti perchè o è diversa la terminologia che usiamo, oppure non so proprio cosa chiedevi. Pensavo in una risposta da cick o valia o GFpina, ma vedo che nemmeno loro non hanno detto nulla.Per quanto mi riguarda per RT- PCR relativa intendevi retrotrascrizione? Ovvero quando dall'RNA ottieni del c-DNA? Se sì, noi non mettiamo controlli interni eso o endogeni, ma solo dei controlli negativi (H2O) e dei positivi ( un camp che sai che viene, anche se quest'ultimo ormai non lo utilizziamo più).
Per l'assoluta per caso è la real time?
DEVO DIRE CHE NON C'HO CAPITO GRAN CHE DALLE TUE DOMANDE!!!!!
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GFPina
Moderatore

GFPina

Città: Milano


8398 Messaggi

Inserito il - 28 settembre 2006 : 17:12:32  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di GFPina  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di GFPina Invia a GFPina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ah bene!
Pensa che io avevo letto (sinceramente! ) un po' velocemente la domanda e pensavo che ti riferissi alla Real Time, e mi aspettavo una risposta di Cin! Io sono ancora alle prime armi con la real time!!

Se ti riferisci invece alla RT-PCR relativa proprio come "retrotrascrizione e PCR" (RT-PCR comparativa e RT-PCR competitiva) prova a guardare questo link:
http://www.biotecnologie2000.com/Articoli/2003/nov_dic/guida_scelta.html
(sempre ammesso che tu non l'abbia già visto! )

Comunque anch'io non ho capito bene le domande e non saprei cosa dirti su controllo esogeno ed endogeno!
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Petemme
Nuovo Arrivato




93 Messaggi

Inserito il - 28 settembre 2006 : 17:55:39  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Petemme Invia a Petemme un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
No no intendo la quantificazione dopo una PCR quantitativa effettuata in modo assoluto o relativo. Per la quantificazione con l'assoluta si fa una curva standard con un gene a concentrazione nota e si ricava la concentrazione del campione (e qui è ok). Per la quantificazione relativa non viene calcolata la concentrazione assoluta del campione, ma si va a guardare se è più o meno espresso rispetto a un gene standard co-amplificato detto controllo ke puù essere esogeno o endogeno (ed è qui ke non ho capito la differenza).
Sarà sicuramente un problema di terminologia, non è la prima volta ke succede..
Il problema forse è ke i miei prof kiamano RT-PCR la PCR quantitativa.. non è corretto forse?
Cmq il mio quesito è sulla PCR quantitativa (qualcuno la indica con QRT-PCR mi sembra o solo Q-PCR)
Ke casotto!!!

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GFPina
Moderatore

GFPina

Città: Milano


8398 Messaggi

Inserito il - 28 settembre 2006 : 18:19:06  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di GFPina  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di GFPina Invia a GFPina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Si in effetti c'è una bella confusione sulla terminologia:
RT-PCR sarebbe "retrotrascrizione e seguente PCR"
quella quantitativa è "RT-PCR quantitativa" oppure "QRT-PCR" (Q-PCR è una abbreviazione anche se personalmente non la trovo molto corretta).

Le parli di PCR quantitaviva in realtà però è sottointeso che sia una RT-PCR quantitativa, in quanto "quantifichi" l'm-RNA non certo il DNA (che non avrebbe senso!)

Poi molti anche la Real Time- PCR la chiamano RT-PCR... e non si capisce più un tubo!!!

Per quanto riguarda i controlli mi continua a sfuggire una cosa:
- un controllo "endogeno" è nel tuo campione, quindi fai un paragone tra il tuo "gene" (o meglio m-RNA!) X e un "gene" espresso in maniera (più o meno!) uguale in tutti i campioni
- un controllo "esogeno" non si trova all'interno del tuo campione, a questo punto cosa faì? Lo inserisci tu? Questo potrebbe essere quello che si fa nella RT-PCR Competitiva dove inserisci un competitore esogeno che compete con il tuo gene!

Non so?

Qualcono ha altre spiegazioni???
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chick80
Moderatore

DNA

Città: Edinburgh


11491 Messaggi

Inserito il - 28 settembre 2006 : 22:01:12  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di chick80 Invia a chick80 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Allora, vediamo di fare un po' di chiarimenti:

1) RT-PCR come ha giustamente detto GFPina è diverso da PCR quantitativa.
RT-PCR = estrai l'RNA, lo retrotrascrivi a cDNA e fai una PCR (classica o real time, non importa)'
Real time PCR = PCR quantitativa, in quanto utilizza uno standard per controllare la quantità di campione.

2) Controlli
In realtime puoi usare o una curva standard con quantità note di un certo gene e poi fare una retta di taratura con quelle (e questo penso sia quello che chiami esogeno) oppure usare un controllo interno al campione es. 18S o comunque un gene espresso costantemente nei tuoi campione (e su questo costantemente ci sarebbe molto da dire).

Il vantaggio di avere un controllo interno è che vai ad analizzare ogni campione con il suo riferimento interno, quindi se ad es in un pozzetto la reazione per qualche motivo non è avvenuta o ha avuto problemi vedrai lo stesso anche nel controllo interno. Lo svantaggio è che devi fare una multiplex (=più reagenti, costo più alto, ci metti di più)
Il controllo esterno è l'unica via [credo] se usi il SYBR Green o composti simili, perchè non avresti modo di fare una multiplex. Lo svantaggio è che confronti tutti i campioni con la stessa curva standard e quindi la variabilità intercampione potrebbe darti dei problemi.

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GFPina
Moderatore

GFPina

Città: Milano


8398 Messaggi

Inserito il - 29 settembre 2006 : 10:12:33  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di GFPina  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di GFPina Invia a GFPina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Meno male che Chick ha fatto chiarezza!!!
La sua qualità di sintesi non ha eguali!

Volevo solo aggingere un paio di cose (cercando di farlo più ordinatamente di ieri!!!)

1) PCR quantitativa
Citazione:
Real time PCR = PCR quantitativa, in quanto utilizza uno standard per controllare la quantità di campione.


ma esistono altri tipi di PCR quantitativa!
Molte ditte continuano a sviluppare kit per dare la possibilità di fare PCR quantitativa anche a chi non possiede lo strumento per la real time (che ha costi elevati, anche se adesso sono notevolmente in discesa!)

Ad es. ci sono PCR Competitiva e PCR Comparativa:
cito dal link: http://www.biotecnologie2000.com/Articoli/2003/nov_dic/guida_scelta.html
Citazione:
RT-PCR Competitiva
Misura la quantità assoluta di un target in un campione di RNA. La procedura impiega un singolo set di primer per amplificare sia il target di interesse sia un RNA competitore esogeno di concentrazione nota che co-amplifica, ma è distinguibile dal gene di interesse. Questa tecnica richiede la costruzione di un templato competitivo.

RT-PCR Comparativa
È simile alla RT-PCR competitiva per il fatto che il target di ogni campione di RNA compete per i reagenti di amplificazione in una singola reazione. Poiché il cDNA di entrambi i campioni hanno lo stesso sito di legame del primer PCR, ogni campione è il competitore dell'altro, rendendo quindi inutile la sintesi di un RNA competitore (che invece è necessaria nella tecnica competitiva). La RT-PCR comparativa richiede invece la retrotrascrizione di due campioni di RNA ognuno dei quali con un primer oligo(dT) di lunghezza diversa che sono mescolati assieme subito prima della PCR. Su gel saranno quindi visibili per ogni campione di RNA due bande distinte: la quantificazione di ogni banda rivela l'abbondanza relativa del target in ogni campione.


2) Controlli
forse sbaglio ma io intendevo diversemente interni/esterni ed endogeni/esogeni!
Controllo interno secondo me è quando il controllo è nella stessa provetta del campione (PCR multiplex come dice giustamente Chick), poi questo controllo interno può essere endogeno se è un gene contenuto nel campione (cioè nell'RNA estratto di partenza!) ad es. 18S (sempre "supponendo" che sia uniformemente espresso in tutti i campioni!). Esogeno invece se non è contenuto nel campione di partenza ma è qualcosa che mischio io al campione! in quantità nota! Può anche essere un templato di sintesi.

Ma forse è più giusta la spegazione di Chick, in effetti in ho sempre sentito parlare di controllo interno o esterno

Il calibratore invece è sempre uno dei tuoi campioni ma "normale".
Ad es. stai analizzando l'espressione del gene X in pazienti con una certa patologia, tra i campioni aggiungi anche un individuo sano e questo sarà il tuo calibratore.
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chick80
Moderatore

DNA

Città: Edinburgh


11491 Messaggi

Inserito il - 29 settembre 2006 : 10:47:28  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di chick80 Invia a chick80 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Mah, in effetti anche io ho sempre sentito interno/esterno e mai endogeno/esogeno per la real-time.

Quella di aggiungere uno standard al campione stesso è una pratica comune nella cromatografia, ma nella PCR non l'ho mai sentito.

Per il fatto che esistano altre tecniche quantitative hai ragione, anche se molte sono piuttosto laboriose e noiose rispetto alla realtime.

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Petemme
Nuovo Arrivato




93 Messaggi

Inserito il - 30 settembre 2006 : 19:53:34  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Petemme Invia a Petemme un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Beh direi ke adesso ho le idee un po' più kiare
Anke se la confusione su questo argomento è notevole
Spero di avere ulteriori kiarimenti con la pratica, più avanti

Grazie a tutti!

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GFPina
Moderatore

GFPina

Città: Milano


8398 Messaggi

Inserito il - 02 luglio 2008 : 01:03:17  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di GFPina  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di GFPina Invia a GFPina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Riprendo questa vecchia discussione visto che il link che avevo indicato ormai da tempo non è più disponibile!
Ma ne ho trovato un altro che mi sembra spieghi le cose in modo abbastanza chiaro, anche se ovviamente facendo pubblicità ai loro prodotti:
RT-PCR: The Basics (Ambion)
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