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pikachu
Nuovo Arrivato
4 Messaggi |
 Inserito il - 22 novembre 2010 : 19:08:48
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salve, premetto ke sono nuova del forum, anke se ammetto ke sta diventando un pò la mia guida in lab!
ho un problema con la PCR che nn riesco proprio a risolvere.....sto cercando di amplificare un tatto mitocondriale (cyt b) per un octopus, ho ordinato dei primer specifici disegnati direttamente sulla seq depositata in banca dati ed utilizzato le stesse condizioni di amplificazione descritte nell'articolo in cui sn descritti i primer, ma alla fine della corsa nn ottengo alcun amplificato e soltanto un enorme residuo in fondo......ho ripetuto la PCR variando alcune condizioni (Tannealing, MgCl), ma ottengo sempre lo stesso risultato....potete suggerirmi altre soluzioni?
grazie
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mak_steon
Utente Junior
138 Messaggi |
Inserito il - 23 novembre 2010 : 09:33:45
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Potrebbe dipendere da tante cose. Senti prima di sparare alla cieca ti chiedo alcune cose:
Hai un positivo? Se non ce l'hai potresti procurartelo?
Il DNA che amplifichi viene da estrazione? che tipo di ext?
Utilizzi BSA o altro contro eventuali inibitori?
Il fatto che facendo tutto quello che è scritto in un articolo non si ottenga gli stessi risultati non è, purtroppo, così strano.
Ciao |
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pikachu
Nuovo Arrivato
4 Messaggi |
Inserito il - 23 novembre 2010 : 21:25:44
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ciao....allora, procediamo con ordine. ovviamente ho fatto sia un controllo positivo ke uno negativo.
sì il DNA deriva da un'estrazione di DNA totale, ottenuta con il metodo del fenolo-cloroformio, al termine della quale devo ammettere di aver ottenuto un DNA degradato. anke altre volte ho avuto qsto risultato, ma sn riuscita cmq ad amplificare....
per qnto riguarda gli inibitori...ma intendi nell'estrazione? nn uso niente veramente...dovrei?
grazie ancora del commento e dei suggerimenti...... |
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paolaindigeno
Nuovo Arrivato
5 Messaggi |
Inserito il - 23 novembre 2010 : 23:06:20
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| A me una volta è successo la stessa cosa ed ho risolto provando con concentrazioni scalari dei primers. Per quanto riguarda il DNA dovresti caricarlo su un gel allo 0.8 % e leggere il rapporto 260/280 allo spettrofotometro. Scusa, ma ho bisogno di farti altre domande.Quando corri il gel dell'amplificazione ti appaiono le bande dei primers dimers? Puoi provare anche ad utilizzare un DNA che hai usato in un'altra PCR e la cui amplificazione è andata a buon fine. Prova anche ad usare concentrazioni scalari di DNA.Gli alti componenti, dNTPs, buffer, MgCl (adesso di solito inserito nel buffer), Taq non influiscono in modo così drastico. Non penso ci sia un problema di inibitori durante l'estrazione! Quanto DNA utilizzi? Quanto è lungo il frammento? Qual è l'anno di pubblicazione dell'articolo? |
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mak_steon
Utente Junior
138 Messaggi |
Inserito il - 24 novembre 2010 : 11:01:00
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No, non durante l'estrazione, io intendevo inibitori della Taq durante l'amplificazione. Spesso con questo tipo di estrazioni, ma anche con i kit a volte, ci portiamo dietro sostanze che poi vanno ad inibire l'attività della polimerasi. Ad esempio a me capita, facendo ext da vino, di portarmi dietro polifenoli o altro che vanno a dare noia alla Taq.
In parte l'ho risolto aggiungendo BSA alla miscela PCR (mi sembra 1 mg/mL comunque ricontrollo)
Se il positivo ti viene bene direi comunque che non si tratta di problemi dovuti alla mix, cioè a concentrazioni non ottimali degli "ingredienti", ma potrebbe essere da imputare all'ext o appunto a eventuali inibitori.
Il positivo l'hai ottenuto nello stesso modo?
Ciao |
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pikachu
Nuovo Arrivato
4 Messaggi |
Inserito il - 25 novembre 2010 : 20:10:59
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| @mak....effettivamente penso ke il problema sia dovuto all'estrazione e alla cattiva conservazione dei campioni....me li hanno spediti in etanolo, ma in realtà penso sia piuttosto alcool denaturato, ke ha perciò compromesso la stabilità del DNA dei campioni...... |
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Gabry
Nuovo Arrivato
Prov.: Ancona
Città: santa maria nuova
64 Messaggi |
Inserito il - 30 novembre 2010 : 10:54:21
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Per la mia esperienza posso dire che la conservazione in etanolo non è la migliore per mantenere i camp degradato ioni di DNA. secondo me il problema della pcr è dovuto principalmente alla degradazione del DNA Citazione:
ottenuta con il metodo del fenolo-cloroformio, al termine della quale devo ammettere di aver ottenuto un DNA
potresti provare sia con un campione positivo che cambiando metodo di estrazione ad esempio un kit. so che non è il massimo per la resa ma potrebbe aiutare a ripulire...
a proposito c'è chi ancora usa il fenolo-cloroformio per estrarre DNA dai campioni? |
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pikachu
Nuovo Arrivato
4 Messaggi |
Inserito il - 01 dicembre 2010 : 21:29:46
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| ciao gabry, purtroppo in lab è radicato qsto metodo obsoleto, anke xkè si fanno molte estrazioni al giorno, e forse un kit, ke offre cmq poke estrazioni, sarebbe anke moltodispendioso, ma io sto avendo un mukkio d problemi, e nn t nascondo ke sto accarezzando l'idea d convertirmi.....me ne potresti suggerire uno ke vada bene x estrarre da muscolo animale? grazie mille! |
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problemi PCR
Didattica
