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Ribu
Nuovo Arrivato
5 Messaggi |
 Inserito il - 23 novembre 2010 : 00:26:04
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Salve ragazzi, è il mio primo intervento, perdonatemi inesattezze e scorrettezze, specie nel modo di pormi per ora.
La mia questione da studente ancora inesperto è questa:
Io so che Sox2, da fattore trascrizionale, è coinvolta nella rigenerazione dei nervi periferici, ma per quanto riguarda il processo non si conoscono i geni target nelle cellule di Schwann.
So inoltre che Sox2 non lega i propri geni target senza formare un complesso ternario, senza legare cioè anche un cofattore (il quale dà la specificità nel riconoscimento dei geni).
Io vorrei chiedere che tecnica posso usare avendo Sox2 purificata come elemento di partenza per individuare i cofattori coinvolti nell'interazione proteina-proteina senza avere però la minima idea di possibili proteine sospette.
Pensavo ad un pull-down, ma su larga scala non penso sia l'ideale.
Ringrazio chiunque voglia dare un contributo :)
Ribu
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SpemannOrganizer
Utente
Città: Los Angeles
955 Messaggi |
 Inserito il - 23 novembre 2010 : 09:34:52
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L'immunoprecipitazione su larga scala esiste, fai immunoprecipitazione e poi identifichi i fattori che interagiscono con Sox2 tramite spettrometria di massa. E' chiaro che tirerai giu' una marea di fattori, essendo un fattore di trascrizione con differenti geni bersaglio (tra l'altro Sox2 è un "pan-neural factor", essendo espresso in tutti i progenitori neurali -per darti un'idea la piastra neurale di Xenopus è tutta sox2 positiva, man mano che le cellule si differenziano Sox2 è downregolato e viene mantenuto solo in un certo numero di neural stem/progenitor cells, se nn erro). Tra questi dovrai identificare quelli che realmente interagiscono con Sox2, quindi dovrai includere opportuni controlli positivi e negativi. Inoltre se a te interessano quelli delle cellule di schwann, forse dovresti trovare un modo per separare tali cellule. Mi pare poco praticabile in vivo, ma forse con cellule in coltura... (non so se vi siano colture cellulari di cell di schwann).
Molto interessante comunque!!!
potresti anche pensare a un two hybrids assay nel lievito... |
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0barra1
Utente Senior
Città: Paris, VIIème arrondissement
3847 Messaggi |
Inserito il - 23 novembre 2010 : 09:53:04
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| Se ne parlava, di isolamento di fattori trascrizionali, ieri. Provare con una cromat d'affinità? |
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Ribu
Nuovo Arrivato
5 Messaggi |
Inserito il - 23 novembre 2010 : 11:33:00
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Esatto SpermannOrganizer, ho passato al notte insonne xD
Avevo pensato proprio ad un saggio a doppio ibrido nel lievito ma poi sono passato allo screening immunologico secondo voi può andar bene? Si effettua creando una proteina di fusione con la GST, Si creano anticorpi contro GST, e poi si usa la prot di fusione come sonda per effettuare uno screening di una libreria di espressione preparata a partire dall'mRNA del tipo cellulare, in questo caso cellule di Schwann..
Poi in futuro userò il pulldown per avere la conferma dei cloni positivi.
Pareri?
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SpemannOrganizer
Utente
Città: Los Angeles
955 Messaggi |
Inserito il - 23 novembre 2010 : 11:51:45
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Come idea è molto buona, solo che anzichè usare un anticorpo contro GST, io userei una colonnina con matrice sefarosio-GSH (glutatione). La GST si crosslinka al GSH e quindi la tua proteina sarà legata alla matrice, al che puoi utilizzare Sox2 per una cromatografia ad affinità. In alternativa puoi usare colonnine Ni-NTA per purificare His-tagged Sox2, ma non so sinceramente se l'interazione è tanto stabile da permetterti di utilizzarle poi per tirare giu' anche gli interattori di Sox2 (l'interazione His-tag con il nichel di Ni-NTA columns è ionica o forse di coordinazione se non erro, e tale sistema è utilizzato piu' che altro per una purificazione diretta della proteina in questione... guarda se trovi qualcosa in letteratura).
Sempre sul tema cromatografie di affinità ti segnalo le colonnine della Pierce biotechnology, costituite da spin columns con una matrice (credo sia agarosio) sulla quale puoi legare covalentemente la tua proteina, per esempio Sox2, che poi utilizzerai come esca per successive purificazioni di interattori. |
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SpemannOrganizer
Utente
Città: Los Angeles
955 Messaggi |
Inserito il - 23 novembre 2010 : 12:06:20
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| domanda: perché usi screening su libreria di espressione e non direttamente estratti proteici da cellule di schwann, magari estratti di proteine nucleari? |
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Ribu
Nuovo Arrivato
5 Messaggi |
Inserito il - 23 novembre 2010 : 19:31:25
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Infatti avrei voluto fare come dicevi tu! Cioè un pulldown con resina al glutatione usando estratti proteici, magari nucleari. Ma immaginavo che sarebbe stato un lavoro troppo impegnativo, cioè troppe proteine e magari molto aspecifico.. prima del pulldown penso mi converrebbe utilizzare lo screening.
Comunque mi dispiace deluderti ma questo è solo un compito a livello progettuale, devo solo utilizzare mie idee per risolvere una problematica biologica, sono solo un normale studente ancora :( |
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SpemannOrganizer
Utente
Città: Los Angeles
955 Messaggi |
Inserito il - 23 novembre 2010 : 19:52:19
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| beh le idee sono buone e, comunque, stanno alla base di qualsiasi progetto ;) |
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Ribu
Nuovo Arrivato
5 Messaggi |
Inserito il - 23 novembre 2010 : 19:55:10
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| Si ma è solo che mi piacerebbe non fermarmi solo qui ;) |
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SpemannOrganizer
Utente
Città: Los Angeles
955 Messaggi |
Inserito il - 23 novembre 2010 : 20:14:13
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| Con calma e arriverà anche il tuo momento nel mondo della ricerca ;) |
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Discussione |
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Individuare interazioni proteina-proteina su larga scala
Didattica
