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cry87
Utente Junior
Città: milano
127 Messaggi |
 Inserito il - 06 dicembre 2010 : 17:58:55
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Ciao,mi spiegate perchè quando clono proteine di fusione il frame di lettura deve essere rispettato mentre nell'alfa-complementazione non è necessario?
grazie mille
Cry
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SpemannOrganizer
Utente
Città: Los Angeles
955 Messaggi |
Inserito il - 06 dicembre 2010 : 20:39:29
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beh ma con l'alfa complementazione il tuo scopo non è avere proteine di fusione. Alfa complementazione si riferisce alla complementazione dei geni per la beta-galattosidasi un enzima che E. coli usa per scindere lattosio in galattosio e glucosio. Questo enzima è costituito da due subunità, se non ricordo male. Nei laboratori di biologia molecolare generalmente si usa un ceppo di E. coli che è difettivo (cioè nn esprime) la subunità alfa, ma esprime l'altra. Ora se tu trasformi questi batteri con un plasmide recante ed esprimente la subunità alfa (per esempio pUC), hai di fatto la complementazione dell'enzima: tutte le subunità vengono espresse ed hai un enzima funzionante. Questo è possibile vederlo con un saggio colorimetrico: trasformi i batteri con il plasmide pUC, li piastri su una piastra contenente ampicillina. il plasmide reca una resistenza all'amp, quindi solo i trasformati cresceranno. Poi sulla piastra metti IPTG (isopropiltiogalattoside, che serve ad attivare l'espressione della subunità alfa che è regolata dal promotore lacZ) ed infine metti l'X-gal che viene idrolizzato dall'enzima completo ed attivo e forma un substrato insolubile blu. Quindi tutte le colonie blu sono quelle che hanno fatto alfa complementazione.
Il bello di questo saggio è che il gene della subunità alfa contiene un polylinkernel quale ci puoi clonare quello che vuoi: il clonaggio all'interno della subunità alfa impedisce la produzione di una subunità funzionale, quindi non hai colonie blu bensi' bianche, che ti indicano appunto che sono quelle le colonie recanti l'inserto.
Viene da se che quando cloni qualcosa all'interno del polylinker della subunità alfa non importa che sia in frame con questa (SE IL TUO SCOPO NON è FARE ESPRIMERE LA PROTEINA AL BATTERIO CON QUESTO VETTORE).
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cry87
Utente Junior
Città: milano
127 Messaggi |
Inserito il - 07 dicembre 2010 : 18:22:32
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quindi concludendo:
se la ligazione è andata a buon fine ho colonie blu (trasformate dal plasmide e che resistono all'ampicillina) mentre se non è andata a buon fine ho colonie bianche che sono selettive per l'ampicillina
è corretto? |
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SpemannOrganizer
Utente
Città: Los Angeles
955 Messaggi |
Inserito il - 07 dicembre 2010 : 19:07:39
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no è sbagliato  ! è il contrario! Se hai colonie recanti il solo plasmide con la subunità alfa intatta (vale a dire all'interno della quale nn c'è inserito nulla)allora avrai colonie blu (lacZ funzionale che scinde X-Gal in colorante blu).
Se invece il tuo clonaggio è andato a buon fine, all'interno della subunità alfa avrai il tuo inserto: risultato= subunità alfa nn funzionale, X-Gal nn idrolizzato, colonie bianche. |
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cry87
Utente Junior
Città: milano
127 Messaggi |
Inserito il - 07 dicembre 2010 : 19:22:44
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ahhhhhh! bene w i miei appunti sbagliati
grazie mille per l'ennesima volta! |
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Discussione |
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clonaggio di proteine di fusione
Didattica
