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_pietro_
Nuovo Arrivato
Città: Lund
104 Messaggi |
 Inserito il - 14 dicembre 2010 : 14:37:21
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Citazione:
Messaggio inserito da Martin.diagnostica
monoclonale dovrebbe essere anche più specifico... Dai visto che tutti noi abbiamo preso cosi a cuore il tuo blot dacci qualche soddisfazioni.
1. Allega (qui ho su un servizio di hosting) la scansione di qualcuna delle tue lastre.
2. Dicci pure il nome della proteina che stai cercando
3. dicci anche il nome del ECL che stai utilizzando.
io in passato ho lavorato su un monoclonale della abcam e funzionava molto bene
in bocca a lupo per il tuo esperimento
La mia proteina e' quella piu' leggera, a sinistra il wt, a destra il mio modello malato.
Immagine:
18,97 KB
Scusa, preferisco non dare troppi dettagli su ricerche non sono pubblicate. Ti posso dire che a quanto pare l'anticorpo non e' ottimo come speravo. Se blocco con latte accade quanto vedete (1:2000, background leggero, ma banda sottilissima). Se bloccassi con BSA 3% (come ho fatto), background nero profondo, ma se illumanata fortemente, la lastra mostra 2 belle bande all'altezza giusta. Quindi quello che penso e' che il mio anticorpo non e' buono.
Il mio ECL? Immobilion Western della Millipore.
Gli anticorpi dell'Abcam per western blot sono i migliori, a mio modestissimo parere, ma questo sta cileccando. E onestamente, mi sta innervosendo!!! 
Aggiornamento:
Come dicevo ieri, ho fatto western con 2 tipi diversi di campione: una membrana con 20ug di proteina da un estratto totale, 10 ug di estratti nucleari nell'altra. Ho provato a diluire l'anticorpo 1:5000 invece di 1:2000. TABULA RASA!
Se blocco con BSA, tanto background (troppo) ma anche segnale. Se blocco con latte, ZERO e per la seconda volta (la prima avevo strippato una membrana).
Avanti.... |
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Martin.diagnostica
Utente Attivo
1582 Messaggi |
Inserito il - 14 dicembre 2010 : 18:12:59
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| Mi sembra di vedere il SIZE marker nella line come "contro-esposto". La lastra non è un gran che da anche aspecifici. L'esperimento con la BSA sembra più interessante, da come lo descrivi mi ricorda una seire di esperimenti con un ab che inizialmente fù molto problematico, poi arrivai a diluire 1:50'00O e funziono magicamanete e dannatamente bene, ti va di postare anche quella? |
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_pietro_
Nuovo Arrivato
Città: Lund
104 Messaggi |
Inserito il - 14 dicembre 2010 : 19:00:03
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Citazione:
Messaggio inserito da Martin.diagnostica
Mi sembra di vedere il SIZE marker nella line come "contro-esposto". La lastra non è un gran che da anche aspecifici. L'esperimento con la BSA sembra più interessante, da come lo descrivi mi ricorda una seire di esperimenti con un ab che inizialmente fù molto problematico, poi arrivai a diluire 1:50'00O e funziono magicamanete e dannatamente bene, ti va di postare anche quella?
No carissimo, non te la posto perche' come ti dicevo e' nera. La devi guardare di fronte a un riflettore da stadio per vederci le bande, che ci sono.
Si', l'anticorpo da aspecifico, ma quello mi preoccupa poco, anche se monoclonale, capita. La lastra non e' un granche', ed e' proprio per questo che scrivo qui ;) . Il fatto del ladder e' il motivo per cui ho voluto provare il BSA. Ho pensato che l'anticorpo reagisse un po' col latte, per cui provai a cambiare il Blocking Buffer. Comunque il suggerimento di superdiluire l'anticorpo e' forte, ma ho la sensazione che visto il segnale, anche 1:50.000 sara' dura non avere Background.
Comunque, aggiornamento: ieri avevo incubato 2 membrane con concentrazione 1:5000, stamattina il risultato e' stato nullo. Ho reincubato con diluizione 1:2000 per 2h a temperatura ambiente e le bande sono uscite. Il background c'e', ma ora il problema e' un altro: in alcuni pozzetti il wt e' overespresso, in altri e' il contrario. 
Mi sa che torno a fare il pescatore, che e' meglio |
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Martin.diagnostica
Utente Attivo
1582 Messaggi |
Inserito il - 14 dicembre 2010 : 19:38:22
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#) ma usi PDVF o nitro? Col PDVF (nono sono sicuro ce si scrive cosi) gli esperimenti venivano meglio
#) Potresti provare a fare il blot wet.
#) Il tuo ECL non mi piace molto io mi trovavo molto bene con questo
SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate
Tuttavia esiste sempre la possibilità che sia colpa del ab. forse ti conviene chiedere ad abcam la sostituzione con un ab di un lotto diverso e magari comprare anche un ctr positivo se lo vendono
Che nostalgia i bei tempi della ricerca quasi quasi me ne torno in Germania |
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_pietro_
Nuovo Arrivato
Città: Lund
104 Messaggi |
Inserito il - 15 dicembre 2010 : 10:29:25
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Si', uso PVDF.
Potrei anche provare un Wet system, ma ho la sensazione che non ci perdero' molto tempo su questo anticorpo, non tanto da chiedere in prestito la macchina ecc. ecc.
Ho sentito parlare del tuo ECL, si.. ho qualche amico che lo usa. Li hai usati entrambi? Che differenze hai notato?
Provero' a contattare l'Abcam per consigli, ma so gia' che mi diranno. A volte sembra di chiamare il call center della TIM |
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Martin.diagnostica
Utente Attivo
1582 Messaggi |
Inserito il - 15 dicembre 2010 : 18:48:11
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Citazione:
Ho sentito parlare del tuo ECL, si.. ho qualche amico che lo usa. Li hai usati entrambi? Che differenze hai notato?
Si li ho usati entrambi quello della PIRCE funzione molto meglio, almeno in base alle mie esperienze |
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_pietro_
Nuovo Arrivato
Città: Lund
104 Messaggi |
Inserito il - 16 dicembre 2010 : 10:26:02
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Ma che sistema usi?
Come prezzi che differenza c'e'? Conviene?
Si utilizza allo stesso modo o ha un "protocollo" diverso? |
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gilthanas
Nuovo Arrivato
100 Messaggi |
Inserito il - 18 dicembre 2010 : 13:09:12
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Allora Pietro....
Il west Pico si usa allo steso modo dell'ECL solo che ha il vantaggio che fai l'incubazione in vaschetta e non sulla mambrana...
sulla sensibilità io preferirei sempre ECL o ECL plus, meglio ancora secondari fluorescenti...ma per un diverso sistema di detection.
Io ho usto sia il west pico che ECL e sono abbastanza simili, se non emglio l'ECL...
nel tuo caso avendo visto il risultato del WB su lastra non penserei ad alzere la concentrazione dell'Ab...soprattutto dal momento che hai spiegato che hai alzato la diluizione e lastra linda.. anzi al max la abbasserei...1:500 o 1:100 e farei l'incubazione in latte overnight...ci sono bande aggiuntive ma l'intesità del segnale è alquanto bassa...spesso capita che un Ab dia delle bande aggiuntive...non mi preoccuperei di quelle, l'importante che non siano proprio vicino alle dimensioni di quelle di interesse...mi capitava per p21 che mi dava sempre una banda alta sui 90 aspecifica..beh amen l'importante che la tua sia buona e delle dimensioni attese...quella alta volendo potevo usarla quasi come housekeeping....
In bocca al lupo |
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sgrencino
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18 Messaggi |
Inserito il - 22 dicembre 2010 : 11:13:56
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Togliti ogni dubbio e fatti cambiare l'Ab, con l'ABCAM hai 120 giorni di tempo.
Perchè non provi a lasciarlo ON a 4°C in PBS-Tween 0,1% con MILK al 5%? |
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