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 RACE con GC rich region
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giulella
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Inserito il - 05 gennaio 2011 : 09:55:49  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di giulella Invia a giulella un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ciao a tutti,

vorrei chiedere il vostro parere riguardo un problema che sto avendo di recente con la 5'RACE.

Dopo aver rimosso il cap dall'RNA, vi ho legato un adapter di sequenza nota e ho continuato con due nested PCR (forward primer per l'adapter e reverse per il mio gene).

Cio' che ottengo su gel di agarosio Ŕ una banda davvero molto intensa.
Dopo clonaggio, ho sequenziato diversi cloni della stessa banda e...ottengo delle sequenze specifiche per il mio gene, ma che differiscono di diversi nucleotidi all'estremitÓ 5 terminale.
In tutti i casi, pero' mi ritrovo la sequenza dell'adapter.
Tuttavia, non ottengo mai l'intera sequenza della 5'UTR predetta, ma bensi' tante sequenze che iniziano in diversi punti del mio esone 1.

Quello che mi sorprende Ŕ la presenza dell'adapter che teoricamente dovrebbe legarsi al posto del cap...

Il mio dubbio Ŕ:

- Ŕ possibile che ci siano tanti inizi della trascrizione per il mio gene???

- Ŕ possibile che cio' che vedo Ŕ dovuto ad un artefatto della PCR, visto che la sequenza dell'esone 1 Ŕ ricca di GC?
In altre parole...Ŕ possibile che durante la PCR la polimerasi "salti" la GC-rich region a causa di strutture secondarie e polimerizzi direttamente il mio adapter??? O peggio, Ŕ possibile che giÓ durante la retrotrascrizione l'enzima ha "saltato" qualche pezzo???

Cosa ne pensate???
Come avete risolto voi eventuali problemi di GC rich region?


Scusate se sono stata un po' prolissa...ma sto letteralmente impazzendo con tutte queste sequenze

Spero in un vostro aiuto...grazie ancora
e tanti auguri per un nuovo splendido 2011
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