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froggyb
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17 Messaggi

Inserito il - 13 gennaio 2011 : 10:22:53  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di froggyb Invia a froggyb un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
ciao a tutti!!! ho un problema: non riesco ad esprimere una proteina.
sono riuscita ad inserirla in 2 plasmidi diversi ma in nessun caso ho avuto l'espressione!!! le analisi di sequenza vanno bene, ma non si induce.
cosa devo fare???
HELP!!!!

Daria85
Utente

aplisia



678 Messaggi

Inserito il - 13 gennaio 2011 : 10:44:28  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Daria85 Invia a Daria85 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
mmm...non che magari la proteina espressa non abbastanza stabile( ovviamente se endogena).
magari viene velocemente degradata, e per questo non sei in grado di ritrovarla...
hai provato dei sistemi di espressione cell-free?

ciao
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froggyb
Nuovo Arrivato



17 Messaggi

Inserito il - 13 gennaio 2011 : 11:37:19  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di froggyb Invia a froggyb un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
grazie per avermi risp cos velocemente.
la proteina non endogena.
inoltre faccio dei prelievi dopo 3 ore dall'induzione e anche over night.
su gel non si vede alcuna banda.
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froggyb
Nuovo Arrivato



17 Messaggi

Inserito il - 13 gennaio 2011 : 11:54:09  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di froggyb Invia a froggyb un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
per quanto riguarda l'espressione cell-free, dopo l'induzione dovrei ultracentrifugare le cellule ed analizzare il lisato su gel??
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Daria85
Utente

aplisia



678 Messaggi

Inserito il - 13 gennaio 2011 : 14:09:43  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Daria85 Invia a Daria85 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
se cell-free non ci sono cellule!:)
un sistema in vitro che permette di sintetizzare una determinata proteina semplicemente utilizzando estratti cellulari eucariotici o procarotici.
una volta avvenuta la sintesi potrai isolare la tua proteina

ma domanda, in che cellule stai lavorando?
perch essenda la tua una proteina di secrezione ci sono diverse cose che potrebbero inficiare la resa, e quindi potresti aver bisogno di stabilizzare la secrezione...
per esempio il peptide segnale potrebbe dare dei problemi, e quindi magari la tua proteina sintetizzata, ma nn viene secreta.
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froggyb
Nuovo Arrivato



17 Messaggi

Inserito il - 14 gennaio 2011 : 10:47:57  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di froggyb Invia a froggyb un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
la mia proteina un fattore di trascrizione. sto lavorando con le BL21.
inoltre ho un p guardato su internet ed ho visto che ci sono proprio dei kit per il cell-free
che nn possiedo e non ne s molto a riguardo....
intanto riprovo le induzioni...
cmq grazie!!!
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