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erestor
Nuovo Arrivato
Città: Pescara
3 Messaggi |
 Inserito il - 20 gennaio 2011 : 14:29:14
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come si può ricavare il dsRNA da trasfettare nelle cellule per il silenziamento genico? cioè, io conosco la sequenza del gene che voglio silenziare, e devo creare un duplex di RNA da trasferire nelle cellule in modo tale che poi il DICER me lo spezza in siRNA e il RISC mi prende il rispettivo antisenso per poter riconoscere poi l'mRNA complementare che verrà così degradato. come lo scelgo il dsRNA e con che metodica lo posso trasfettare?
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Dionysos
Moderatore
Città: Heidelberg
1913 Messaggi |
Inserito il - 20 gennaio 2011 : 14:41:13
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Credo che si utilizzi la trascrizione in vitro con successivo annealing
e che l'RNA sia introdotto tramite elettroporazione. |
Volere libera : questa é la vera dottrina della volontà e della libertà
(F.W. Nietzsche)
Less Jim Morrison, more Sean Morrison!
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erestor
Nuovo Arrivato
Città: Pescara
3 Messaggi |
Inserito il - 20 gennaio 2011 : 14:48:06
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| ok! quindi sfrutto gli estratti nucleari per ottenere l'RNAm, me lo isolo e poi lo faccio appaiare. grazie mille! |
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SpemannOrganizer
Utente
Città: Los Angeles
955 Messaggi |
Inserito il - 20 gennaio 2011 : 15:11:36
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in cultured cell di Drosophila facevamo come ti ha detto dionysos, ossia trascriviamo in vitro i filamenti di rna senso e antisenso, che poi vengono appaiati. E' sufficiente amplificare la regione che ti interessa by pcr, per esempio un particolare esone di un cDNA, utilizando primers specifici per questo esone e che portino alla loro estremità il promotore per una RNA pol (mi pare usassi la T3, ma nn ci giurerei).
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Dionysos
Moderatore
Città: Heidelberg
1913 Messaggi |
Inserito il - 20 gennaio 2011 : 15:58:40
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Citazione:
ok! quindi sfrutto gli estratti nucleari per ottenere l'RNAm, me lo isolo e poi lo faccio appaiare. grazie mille!
No, per in vitro intendo "in provetta", da plasmidi con il T7 promoter.
Dovrebbe essere più efficiente e sicuramente garantirà una maggior purezza |
Volere libera : questa é la vera dottrina della volontà e della libertà
(F.W. Nietzsche)
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zerhos
Utente Junior
Prov.: Pisa
Città: Pisa
421 Messaggi |
Inserito il - 21 gennaio 2011 : 15:44:48
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Io eseguo esperimenti di RNAi
utilizzo generalmente il Pgem T easy, dove c'è l'inserto precedentemente clonato;
Con questo faccio le due trascrizioni in vitro separate, una da t7 e l' altra da sp6 (i primotori ai due opposti del vettore);
stimo le concentrazioni dei due single strand che ho ottenuto, se sono uguali le mischio e le faccio appaiare.
Poi io personalmente utilizzo la microiniezzione per introdurre il dsRNA. |
"l'unica differenza tra me e un pazzo è che io non sono pazzo!"
Salvador.Dalì
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SpemannOrganizer
Utente
Città: Los Angeles
955 Messaggi |
Inserito il - 21 gennaio 2011 : 16:54:21
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| microiniezione? Lavori su xenopus forse? |
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zerhos
Utente Junior
Prov.: Pisa
Città: Pisa
421 Messaggi |
Inserito il - 21 gennaio 2011 : 19:47:07
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| no, in realtà mi occupo di rigenerazione, lavoro su planaria |
"l'unica differenza tra me e un pazzo è che io non sono pazzo!"
Salvador.Dalì
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SpemannOrganizer
Utente
Città: Los Angeles
955 Messaggi |
Inserito il - 21 gennaio 2011 : 19:56:02
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| uhmmmm... vedo che sei di Pisa, nn è che lavori con o vicino al gruppo della Barsacchi? io ero in tesi li' a Pisa (pur avendo fatto il corso di laurea a siena) e stavo nel gruppo Barsacchi-Andreazzoli, ricordo c'era un prof che lavorava su planaria, ma nn ricordo il nome del prof. |
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chemistry88
Nuovo Arrivato
21 Messaggi |
Inserito il - 22 gennaio 2011 : 13:35:07
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| ragazzi scusate sapete se esiste l'mrna poke poke e se il trascritto primario eucariotico puo circolarizzare..grazie |
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RNA interference
Didattica
