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MASATEAR
Nuovo Arrivato
22 Messaggi |
 Inserito il - 22 gennaio 2011 : 23:53:34
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ciao ragazzi...sto utilizzando il Facs da pokissimo....ma ho dei problemi a interpretare i risultati che mi mostra la mia proff...
in particolare stiamo testando vari tipi di anticorpi sulle cellule del sangue T ma non ho capito a cosa serve l'anticorpo IgG legato al suo fluoroforo e perkè lo usiamo come controllo negativo.....qualcuno fa lo stesso??
grazie mille!
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Dionysos
Moderatore
Città: Heidelberg
1913 Messaggi |
Inserito il - 23 gennaio 2011 : 01:41:16
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Ciao,
gli anticorpi di controllo d'isotipo sono anticorpi fluorocromo-coniugati
costruiti in modo identico a quelli che usi per riconoscere una tal molecola,
con la differenza che hanno una regione variabile che non riconosce nessun
antigene noto, e sono validati in tal senso.
Servono per poter valutare il rumore di fondo nel segnale emess da un anticorpo
di corrispondente isotipo (ad es. IgG) e coniugato con lo stesso fluorocromo (ad es. PE).
Per sempio se marchi i monociti con un anticorpo IgG anti-CD14 PE-coniugato,
il segnale di PE restituito dalla macchina sarà uguale alla somma del segnale
specifico per CD14 (prodotto dal legame della regione variabile ) e del segnale
non specifico prodotto dal legame della regione Fc della tua IgG ai recettori FcR
del monocita, oppure a qualsiasi altro fenomeno di adsorbimento del tuo anticorpo.
Se in un campione parallelo esegui una marcatura identica con l'isotype control,
potrai capire qual è l'entità del segnale proveniente dalle porzioni dell'anticorpo
diverse dalla regione veriabile. Idealmente, se la marcatura di riferimento è tutta
specifica per la regione variabile, l'isotype control non dovrebbe dare alcun segnale.
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Volere libera : questa é la vera dottrina della volontà e della libertà
(F.W. Nietzsche)
Less Jim Morrison, more Sean Morrison!
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MASATEAR
Nuovo Arrivato
22 Messaggi |
Inserito il - 23 gennaio 2011 : 10:20:46
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Grazie mille!Ma a questo punto se invece mi da del segnle cosa dovrei pensare?visto ke non puo legarsi al mio antigene noto..... |
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Dionysos
Moderatore
Città: Heidelberg
1913 Messaggi |
Inserito il - 23 gennaio 2011 : 11:54:29
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Vuol dire che il tuo staining deve essere ottimizzato perchè in queste
condizioni c'è troppo anticorpo e questo viene troppo adsorbito dalle
cellule in modo aspecifico. Puoi provare a ridurre la quantità di Ab,
la temperatura e la durata dell'incubazione. Importante è anche fare
un blocking adeguato prima di marcarle (tipo rat serum 5% v/v) e, nel
caso delle cellule ematopoietiche, bloccare i recettori FcR.
Comunque un minimo di segnale è normale che lo dia, ma dev'essere minimo
in proporzione al segnale del tuo campione marcato con l'anticorpo "vero"
(dipende dall'MFI del tuo antigene, se è "hi" puoi non preoccuparti troppo) |
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Isotype IgG PE in Facs
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