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 trasfezione strano problema
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Tommasina
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Inserito il - 28 gennaio 2011 : 22:31:57  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Tommasina Invia a Tommasina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ho un problema nella trasfezione. Sto analizzando il promotore che codifica per un fattore di splicing cellulare, attraverso il saggio del cloramfenicolo acetiltrasferasi. Trasfetto le cellule con un vettore pcDNA 3.1 che esprime una proteina X. Ottengo che la mia proteina inibisce l'espressione del mio gene in un sistema cellulare, in un altro sistema cellulare lo stimola ma in entrambi ho una cosa stranissima: com'Ŕ possibile che io ottenga un effetto di inibizione sull'espressione di tale fattore anche nella condizione di controllo con il vettore vuoto? Ho ripetuto l'esperimento un miliardo di volte, cambiato reagenti, cambiato stock di DNA plasmidico, ripetuta la maxi prep per avere DNA piu pulito. Ho pensato a qualche agente tossico batterico che mi tiro dietro dopo la mia trasfezione, ma non so piu cosa pensare. potrebbe essere tossica la trasfezione: ho provato con Lipofectamine, Lipofectine e Fugene 6. ogni volta stessso risultato.
Eseguo cosi la trasfezione:preparo la miscela di trasfezione con questo rapporto: DNA 1
Lipo 3 OptiMem 30
Incubazione 40 min room T
metto sulle cellule goccia a goccia
4 h incubazione
aspiro via la miscela di trasfezione
aggiungo il medium

Cosa mi consigliate?
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