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Tommasina
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29 Messaggi

Inserito il - 31 gennaio 2011 : 20:19:19  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Tommasina Invia a Tommasina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ho un problema nella trasfezione. Sto analizzando il promotore che codifica per un fattore di splicing cellulare, attraverso il saggio del cloramfenicolo acetiltrasferasi. Trasfetto le cellule con un vettore pcDNA 3.1 che esprime una proteina X. Ottengo che la mia proteina inibisce l'espressione del mio gene in un sistema cellulare, in un altro sistema cellulare lo stimola ma in entrambi ho una cosa stranissima: com'č possibile che io ottenga un effetto di inibizione sull'espressione di tale fattore anche nella condizione di controllo con il vettore vuoto? Ho ripetuto l'esperimento un miliardo di volte, cambiato reagenti, cambiato stock di DNA plasmidico, ripetuta la maxi prep per avere DNA piu pulito. Ho pensato a qualche agente tossico batterico che mi tiro dietro dopo la mia trasfezione, ma non so piu cosa pensare. potrebbe essere tossica la trasfezione: ho provato con Lipofectamine, Lipofectine e Fugene 6. ogni volta stessso risultato.
Eseguo cosi la trasfezione:preparo la miscela di trasfezione con questo rapporto: DNA 1
Lipo 3 OptiMem 30
Incubazione 40 min room T
metto sulle cellule goccia a goccia
4 h incubazione
aspiro via la miscela di trasfezione
aggiungo il medium

Cosa mi consigliate?

domi84
Moderatore

Smile3D

Cittā: Glasgow


1723 Messaggi

Inserito il - 31 gennaio 2011 : 21:16:56  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di domi84 Invia a domi84 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Non lo so, mi verrebbe da dirti:
Hai provato a sequenziare il DNA "vuoto" per vedere se veramente č vuoto?

Il mio blog: http://domi84.blogspot.com/
Le foto che ho scattato...
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RM
Nuovo Arrivato



115 Messaggi

Inserito il - 01 febbraio 2011 : 08:51:27  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di RM Invia a RM un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Per quanto ne so, č un fenomeno abbastanza comune. Il dna esogeno non č completamente "inerte"
Sia il dsDNA che il dsRNA inducono risposta antivirale, per esempio. Prova ad usare meno dna, ad esempio titolando qual'e la concentrazione minima che non induce risposta. A me ha funzionato (con i siRNA)
Ciao
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